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解决方案

NadPrep^®️ 血浆游离 DNA 双端分子标签文库构建试剂盒（for MGI）

货号：

#1002211 #1002212
#1003811 #1003821 #1003822 #1003820
#1003911 #1003921 #1003922 #1003925 #1003926

NadPrep^®️ 血浆游离 DNA 双端分子标签文库构建试剂盒（for MGI）是针对基于 DNBSEQ™ 技术的 MGI 高通量测序平台开发的双链 DNA 文库构建试剂盒。该试剂盒基于 A-T 连接原理，操作流程简单，适用于 1-500 ng 血浆游离DNA的全基因组测序，同时兼容液相杂交靶向捕获测序。

该试剂盒搭配双端分子标签（Bi-Molecular Identifier, BMI）接头，可满足血浆游离 DNA 低频突变分析的需求。

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产品特色

适用于血浆游离 DNA
样本起始量低，文库转化率高
双端分子标签接头助力低频突变分析
包含 DNA 纯化磁珠，并适配优化的片段筛选方案
单端接头（Single Index, SI）和双端唯一接头（MGI Unique Dual Index, MDI）可选

建库应用

应用方向	样本类型	推荐起始量
全基因组测序	血浆游离 DNA（无大片段污染）	≥ 1 ng（依据检测需求调整）
靶向捕获测序	血浆游离 DNA（无大片段污染）	≥ 1 ng（依据检测需求调整）

建库流程

流程图

产品表现

文库产出稳定高效

图1. NadPrep^®️ 血浆游离 DNA 双端分子标签文库构建试剂盒（for MGI）对不同 DNA 起始量的文库产出。A. 搭配 NadPrep^®️ BMI Adapter (MDI) Module 时 cfDNA 文库的产出稳定；B. 搭配 MDI 接头模块时的 cfDNA 文库片段分布示例（Agilent 2100 Bioanalyzer）。

分子标签助力低频突变分析

图2. 双端分子标签分析原理示意图。

来源于两个健康捐献者的 cfDNA 以 1% 比例混合，文库制备总投入量为 10 ng，人工模拟 1% 及 0.5% 突变。在 MGISEQ-2000 测序平台上，利用双端分子标签，在不同分析与过滤方法下进行低频突变分析的结果示例如下。

表1. 低频突变分析过滤方法

分析与过滤方法	详情
No BMI	根据片段在基因组上比对的起始、终止位点去除重复。
SSCS	利用单链分子标签进行一致性分析（Call Molecular Consensus Reads），形成单链一致性序列（Single Strand Consensus Sequence, SSCS）。
DCS211 / DCS633	利用双链分子标签，即互补链（Top / Bottom）分子标签进行一致性分析，形成双链一致性序列（Duplex Consensus Sequence, DCS），且 Top 与 Bottom Reads 均 ≥1（DCS211）/ 3（DCS633）。
DCS211 (≥ 2) / DCS633 (≥ 2)	在DCS211 / DCS633 的基础上，支持该突变的DCS一致性序列 ≥ 2。

图3. 不同分析模式对于 1% 和 0.5% 模拟突变位点的 A. 灵敏度与 B. 阳性预测值。

图4. 不同分析模式对背景 “噪音” 的过滤情况。

本产品仅限研究使用，不用于临床诊断。

通用建库模块

包装编号	管盖颜色	组分名称	包装体积 1002211(24 rxn)	包装体积 1002212 (96 rxn)
Box1		EndRepair & A-Tailing Buffer	180 µL	690 µL
		End Repair & A-Tailing Enzyme	120 µL	460µL
		Ligation Buffer	750 µL	2×1500 µL
		DNA Ligase	65 µL	250 µL
		2X HiFi PCR Master Mix	720 µL	2×1600 µL
		NadPrep M-Amplification Primer Mix (for MGI, SI)	20 µL	75 µL
		NadPrep M-Amplification Primer Mix (for MGI, DI)	20 µL	75 µL
		NadPrep M-Amplification Primer Mix (for MGI, DI)	20 µL	75 µL
	/	Nuclease Free Water	2.5 mL	8 mL
		TE Solution	1 mL	4 mL
Box2	/	NadPrep SP Beads	4 mL	15 mL

分子标签接头模块

管盖颜色	组分名称	包装体积 1003811 (24 rxn)	包装体积 1003821 (96 rxn)	包装体积 1003822(96 rxn)
	NadPrep M-Index (SI) Primer Mix #	12×15 µL	24×25 µL	24×25 µL
	NadPrep BMI-Adapter	60 µL	230 µL	230 µL

包装编号	管盖颜色	组分名称	包装体积 1003820 (480 rxn)
Box1		NadPrep M-Index (SI) Primer Mix #	96×30 µL
Box2		NadPrep BMI-Adapter	1100 µL

双端唯一接头模块

管盖颜色	组分名称	包装体积 1003911 (24 rxn)	包装体积 1003921 (96 rxn)	包装体积 1003922(96 rxn)	包装体积 1003925 (96 rxn)	包装体积 1003926 (96 rxn)
	NadPrep M-Index (MDI) Primer Mix #	12×15 µL	24×25 µL	24×25 µL	24×25 µL	24×25 µL
	NadPrep BMI-Adapter	60 µL	230 µL	230 µL	230 µL	230 µL

如何理解 UMI 分析中的 read-structure 即 3M4S+T（MGI 测序平台）？

这是指读长的结构，其中 M 为分子标签读长；S 为忽略的碱基读长；T 为模板读长；“+”代表剩余碱基均为模板读长。双端应分别设置。对于每条 read 的前 7 个碱基：前三个是 UMI，后 4 个是固定碱基，第 8 个碱基即为插入序列第一个碱基，故 UMI 分析时需提取前 3 个碱基。

NadPrep® 血浆游离 DNA 双端分子标签文库构建试剂盒对 cfDNA 样本有哪些具体要求？

NadPrep^® 血浆游离 DNA 双端分子标签文库构建试剂盒对 cfDNA 样本的定量及片段质检，建议如下：

类别	要求
提取试剂盒推荐	cfDNA	QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit（Qiagen；货号：55114）
溶剂	推荐使用无核酸酶水、0.1 × TE（low TE）、10 mM Tris-HCl（pH 8.0~8.5）或提取试剂盒配备的Buffer溶解DNA样品。酶切片段化试剂多对EDTA浓度敏感，应避免使用含EDTA的溶剂溶解。如有必要可进行1.8-2.0 ×磁珠纯化去除。
定量	基于分光光度计原理的NanoDrop和基于双链DNA荧光染料的Qubit®、PicoGreen®进行定量。
纯度	OD₂₆₀/OD₂₈₀=1.8-2.0；OD₂₆₀/OD₂₃₀=2.0-2.5。OD₂₆₀/OD₂₈₀>1.9表明有 RNA 污染，<1.6表明有蛋白质、酚等污染；OD₂₆₀/OD₂₃₀<2.0，则表明有碳水化合物、盐类或者有机溶剂污染。
片段分布	cfDNA	Bioanalyzer或Bioptic（Qsep）分析主峰~160 bp，次峰~320 bp。

接头使用注意事项及推荐？

接头比例过高会导致接头或接头二聚体残留；接头比例若不足则会影响连接效率进而降低文库产量。接头使用还应注意保存方式、稀释方法和稀释浓度：

• 保存：避免反复冻融，如欲多次使用，应提前分装；

• 稀释液：推荐使用试剂盒内TE Solution进行接头的稀释，但稀释液不建议长期保存；

• 稀释用量：根据样本起始投入量、片段大小，计算合适的接头与DNA片段摩尔比，可达最佳产量。

• 实验操作：保持连接反应在冰上进行，接头与连接体系分别加入，避免提前自连。

• 不同的接头类型应用推荐如下表：

应用	推荐NadPrep接头	可选NadPrep接头
全基因组、宏基因组、液相杂交靶向捕获测序	Universal Adapter (SI/DI) Module	BMI Adapter (SI/DI) Module
RNA测序	BMI Adapter (SI/DI) Module	Universal Adapter (SI/DI) Module
低频突变检测（~1%或以下突变频率）	BMI Adapter (SI/DI) Module	-

如何提高回收效率?

推荐以下操作以提高回收效率：适当增加孵育时间；适当提高磁珠纯化倍数（如纯化样本步骤，非片筛）；使用新鲜配制的 80% 乙醇。

是否支持PCR-Free文库构建及其注意事项？

不支持。

文库的定量方法推荐及注意事项？

针对不同建库方式及后续应用，推荐的定量方法如下:

• 常规文库：使用 Qubit 进行定量；

• 应用于多样本混杂的靶向捕获测序文库：为提高数据均一性，可使用qPCR绝对定量的方法进行浓度测定，如：VAHTS^TM Library Quantification Kit for MGI，Vazyme，货号：NQM101-NQ106。

文库构建结果出现峰型异常的原因及解决办法？

文库长度分布可通过凝胶电泳、Bioanalyzer或者 Bioptic（Qsep）等生物分析系统进行检测，但应注意不同分析仪器的文库片段读数可能会存在一定的偏差。常见的异常文库片段分布原因如下：

异常峰型	产生原因	解决办法
有短片段（~100 bp）小峰	接头冗余	合适的Input DNA量和接头使用量；注意加样及连接条件
有双峰（额外单个短片段峰）	过度扩增	降低Input DNA量，降低扩增循环数
额外有长片段峰	磁珠残留	纯化步骤时小心操作，以去除全部磁珠

文库是否兼容 Agilent、Roche、艾吉泰康靶向捕获平台？

除适配纳昂达科技自有靶向捕获体系外，文库也适配市面上多种靶向捕获体系，如 Twsit（Twist Custom Panel）、IDT（IDT xGen™ Lockdown™ Probes）、Agilent （Agilent SureSelect）、Roche（ Roche^® NimbleGen™ SeqCap™ EZ）、艾吉泰康（TargetSeq^®液相探针捕获技术）等。

该试剂盒是否兼容自动化工作站平台？

兼容。PerkinElmer Sciclone G3 NGSx 等自动化工作站上已有完整的配套程序并经过测试，适配表现良好。

吸取部分试剂时，移液器吸头上有溶液残留，如何解决？

试剂盒内 Ligation Buffer、 DNA Ligase、End Repair & A-Tailing Enzyme 等试剂较为黏稠，建议上下颠倒或反复轻弹融解混匀。操作过程中使用低吸附吸头，缓慢平稳吸取与释放。如吸头有试剂残留可反复吹吸或使用反向移液法，务必确保加液的准确性。

类别	产品	详情	货号
建库模块	NadPrep^®️ DNA Library Preparation Module (for MGI), 24 rxn	24 rxn	1002211
建库模块	NadPrep^®️ DNA Library Preparation Module (for MGI), 96 rxn	96 rxn	1002212
单端接头模块	NadPrep^®️ BMI Adapter (SI) Module Set A1 (for MGI), 24 rxn	SI 1-12	1003811
	NadPrep^®️ BMI Adapter (SI) Module Set D1 (for MGI), 480 rxn	SI 1-96	1003820
	NadPrep^®️ BMI Adapter (SI) Module Set B1 (for MGI), 96 rxn	SI 1-24	1003821
	NadPrep^®️ BMI Adapter (SI) Module Set B2 (for MGI), 96 rxn	SI 25-48	1003822
双端唯一接头模块	NadPrep^®️ BMI Adapter (MDI) Module Set A1 (for MGI), 24 rxn	MDI 1-12	1003911
	NadPrep^®️ BMI Adapter (MDI) Module Set B1 (for MGI), 96 rxn	MDI 1-24	1003921
	NadPrep^®️ BMI Adapter (MDI) Module Set B2 (for MGI), 96 rxn	MDI 25-48	1003922
	NadPrep^®️ BMI Adapter (MDI) Module Set B3 (for MGI), 96 rxn	MDI 49-72	1003925
	NadPrep^®️ BMI Adapter (MDI) Module Set B4 (for MGI), 96 rxn	MDI 73-96	1003926

本产品仅限研究使用，不用于临床诊断。