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实验技囊 | 甲基化靶向捕获的八个注意点

浏览量:2946 / 发布时间:2022-06-23

甲基化靶向测序实战

/Tips/


纳昂达科技自 2021 年 6 月陆续上线甲基化靶向捕获测序方案,一经推出便受到广泛关注和使用。甲基化文库构建较常规建库流程长且繁琐,我们的研发人员和资深客户总结了实验操作过程中的要点,供大家参考。


Q

预文库构建

/Library preparation/

A

1、酶转化模块相较于其它转化方法,在低起始量 (10 ng) 和常规起始量 (200 ng) 下,文库质量更高、插入片段更长、文库复杂度也更高,并且 CpG 转化一致性也更好[1]。因此,我们建议首选酶转化模块法构建甲基化预文库。

2、相较于高起始量样本而言,低起始量的样本 (<50 ng) 文库产量的变异系数更大,因此,我们推荐使用 QubitTM 荧光计 (Thermo Fisher Scientific) 对 DNA 样本进行定量并准确移液,确保文库的稳定产出。

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图 1 | 不同投入量的文库产出。利用 NadPrep® Methyl Library Preparation Module 搭配 NadPrep® Methyl Stubby Adapter (UDI) Module (for Illumina®) 经酶学转化后进行文库构建,投入量分别为 5 ng 和 50 ng。

3、酶转化模块操作中,脱氨基反应体系中会引入 BSA (牛血清白蛋白),其残留会导致磁珠在乙醇洗脱晾干后易成团,影响文库的洗脱,使得文库产量低。因此,我们推荐在乙醇洗脱并彻底去除之后,立刻加入 TE,尽量避免磁珠干燥影响洗脱回收效率。

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图 2 | 磁珠干燥程度的产出表现。利用 NadPrep® Methyl Library Preparation Module 搭配 NadPrep® Methyl Stubby Adapter (UDI) Module (for Illumina®) 经酶学转化后进行文库构建,投入量均为 5 ng,扩增 10 个循环。

4、酶转化法脱氨基反应纯化步骤,进行转化产物洗脱转移时,应尽量吸取 20 μL 洗脱液。若该步骤吸取了少量磁珠,并不影响后续的 PCR 扩增。事实上,即使不进行洗脱液的转移,带磁珠进行 PCR 扩增,也不会降低后续文库产出。推荐带磁珠进行 PCR 扩增,既减少文库损失,又简化操作流程。

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图 3 | 带磁珠扩增的产出表现。利用 NadPrep® Methyl Library Preparation Module 搭配 NadPrep® Methyl Stubby Adapter (UDI) Module (for Illumina®) 经酶学转化后进行文库构建,投入量均为 5 ng,扩增 10 个循环。

Q

杂交捕获

/Hybridization capture/

A

1、杂交实验前建议测试耗材在杂交条件下的密封性能,确保 16 h 杂交时长下的损失 < 1 μL,否则将影响捕获结果的稳定性。

2、甲基化捕获的杂交和洗脱温度应均为 63℃,相较于 65℃,63℃ 时数据覆盖均一性表现更好,低 GC 区域覆盖度更优。

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图 4 | 覆盖均一性和一致性及 GC 偏好性。利用 NadPrep® Methyl Library Preparation Module 搭配 NadPrep® Methyl Stubby Adapter (UDI) Module (for Illumina®) 经酶学转化后进行预文库构建,以甲基化 demo Panel (60 K) 完成杂交捕获。测序模式:Illumina Novaseq 6000,PE 150。

注:甲基化阳性对照 100% Methylated DNA (zymo, D5014-2) 和阴性对照 0% Methylated DNA (zymo,D5014-1),经不同比例混合以模拟不同甲基化水平 (0%,10%,50% 和 100%)。

3、热洗脱去上清步骤时,应尽量去除底部残液并快速操作,否则会降低捕获中靶率。推荐在移弃 Wash Buffer 1 和 Wash Buffer 2 后瞬时离心,放置于磁力架上,再用 10 μL 吸头进一步去除底部残液 (常温洗脱可同样操作;此外,常温洗脱在第一步加入 Wash Buffer 1 吹吸混匀之后转移至新的 PCR 管,有助于提升中靶率)。

4、在 Post-PCR 时,推荐在纯化前对杂交后的甲基化文库进行定量,若浓度 <2 ng/μL,建议额外扩增 1~3 循环,以保证获得足量文库进行测序。

最后,祝小伙伴们实验顺利!

比心

关于纳昂达科技

纳昂达科技秉承“ Nano Trans More ”的核心理念和“靶向精准,用心服务诊断”的奋斗宗旨,致力于为科研院校、医疗机构、临检单位、产业公司、测序服务商等提供专业化和高质量的靶向测序产品与闭环解决方案。

纳昂达科技已通过高新技术企业、江苏省科技型中小企业和南京市精准高通量测序工程技术研究中心认定,并拥有 > 2,000 平米的高通量测序研发中心和 >  4,000平米的 GMP 级别 (YY/T 0287-2017 idt ISO 13485:2016) 体外诊断试剂生产基地,建立了从市场调研、产品设计、生产制造到售后服务完整的质量管理体系。

纳昂达专注于精准靶向试剂和配套自动化仪器的开发、生产、销售和服务,目前拥有 MGI 和 Illumina 双测序平台多款 NadPrepⓇ 文库构建试剂盒和全套液相杂交相关产品。明星产品包括 NGS 全流程自动化工作站、肿瘤全外显子 Panel、泛实体瘤和血液肿瘤 Panel 以及呼吸道病毒 Panel 等,并提供全面完善的双平台捕获探针定制化服务。纳昂达科技的靶向捕获产品拥有与国际同行业媲美的高质量水准,获得了客户一致的信赖。

纳昂达的销售网络覆盖全国并已外延至海外地区。纳昂达将与客户共成长,对客户的需求全力以赴,为全球用户提供靶向测序解决方案和 IVD 试剂原料。

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[1] Morrison J, Koeman J M, Johnson B K, et al. Evaluation of whole-genome DNA methylation sequencing library preparation protocols[J]. Epigenetics & chromatin, 2021, 14(1): 1-15.