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实战!纳昂达液体活检方案 carry 突变分析

浏览量:3206 / 发布时间:2022-08-22

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背景

基于血液的非侵入性液体活检和游离 DNA (cfDNA) 分析为癌症基因组的研究提供了新的途径,在过去十年中得到了快速发展。然而肿瘤患者血液 cfDNA 中携带的大部分基因突变,可能并不是来自于癌细胞,而是血液中的白细胞。

克隆性造血是一种常见的衰老相关过程,其涉及造血干细胞中与白血病相关的体细胞突变的积累,可导致克隆扩增,且可能引发血液恶性肿瘤。从 2017 年以来,MSKCC 和 GRAIL 公司联合研究团队就发现肿瘤患者的 cfDNA 中,克隆性造血带来的变异达到了 53.2%;而在健康人群中更是高达 81.6%[1]。克隆性造血相关突变也存在肿瘤组织中,从而干扰肿瘤突变图谱分析结果[2]

因此,在液体活检中应进行严格的白细胞对照分析,过滤克隆性造血突变。

本文中,我们主要分享纳昂达液体活检检测方案应用于真实样本和克隆性造血突变分析的示例。

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实验设计

样本来源

样本为匿名的 3 例结直肠癌患者的 FFPE 组织配对样本和血液样本,编号分别为 CC1、CC2 和 CC3,具体样本信息见表1. 。其中 FFPE 组织样本和血液白细胞样本 DNA 的投入量均为 100 ng,血液 cfDNA 投入量为 25 ng。

表1. 结直肠癌患者临床信息

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捕获测序

提取的 gDNA 和 cfDNA 利用 NadPrep® DNA 通用型文库构建试剂盒构建预文库后 (cfDNA 文库含 BMI 双端分子标签),进行靶向捕获测序,测序平台为 MGISEQ-2000。捕获 Panel 为 NanOnCT v1.0 泛癌液体活检 Panel,NanOnCT 靶向实体瘤研究中被着重关注的 69 个基因,例如已进入非小细胞肺癌诊疗指南的 ALK、BRAFEGFRERBB2METRETROS1NTRK 等基因,覆盖基因组约 375 Kb 区域。其探针设计经过优化,提升了对 cfDNA 构建文库的捕获效果。

相关试剂信息和分析软件如表2. 和表3. :

表2. 建库和杂交捕获试剂信息表

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表3. 分析软件列表

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gDNA 和 cfDNA 捕获测序表现

捕获测序的结果显示,真实结直肠癌的 FFPE 组织配对样本、白细胞 gDNA 和 cfDNA 的中靶率均 >80%,且在覆盖均一性上均有优异的表现 (如图1. )。不过由于肿瘤样本异质性较高,均一性指标 0.5x mean depth coverage 略低于对照。另外,cfDNA 捕获结果在低 GC 区域的深度比 DNA 的低,这与 AT-rich cfDNA 在血液中更容易降解有关系。

  • gDNA

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图1-gDNA-01
图1-gDNA-02
图1-gDNA-03


  • cfDNA

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图1-cfDNA-01
图1-cfDNA-02
图1-cfDNA-03

图1. 临床样本 gDNA 和 cfDNA 靶向捕获结果

注:B:白细胞;C:癌旁对照;T:肿瘤组织

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体细胞突变分析

我们首先分别使用癌旁组织和白细胞作为对照,评估结直肠癌患者肿瘤组织的体细胞突变结果的一致性。结果显示,3 个样本的体细胞突变在两种分析方法下突变位点和频率几乎完全一致 (表4. )。CC1 样本检出有 2 个致病突变,分别为 KRAS-G12V 和 AKT1-E17K;CC2 样本有 3 个致病突变,分别为 PIK3CA-E545K、KRAS-G12C 和 TP53-R81X。CC3 样本检出 1 个 TP53 的 stop-gain 无义突变,由于其位于 P53 的 DNA 结合结构域 (DNA binding domain),该突变也很有可能是致病突变。

表4. 肿瘤组织的体细胞突变分析结果

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我们紧接着利用含分子标签的超高深度测序对患者的 cfDNA 进行突变分析,且仅使用数据库信息过滤胚系突变,理论上此时的突变结果将包含体细胞突变和来源于白细胞的克隆性突变。CC2 样本的致病突变结果与肿瘤组织的一致,并额外检出 1 个突变频率为 0.67% 的 TP53-Y88C 可疑突变 (表5. )。CC2 样本 cfDNA 中致病突变的频率非常接近肿瘤组织中的突变频率,可能是由于 FFPE 肿瘤组织纯度不高以及 ctDNA 占比较高有关。CC2 样本为肿瘤 IV 期患者,此阶段血液中 ctDNA 的占比一般较高,也更容易检测到肿瘤组织中的体细胞突变。

表5. cfDNA 的突变分析结果

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尽管 CC1 和 CC3 样本经分子标签单链一致性分析后的有效深度分别达到了 6,900x 和 8,700x,但均未检出致病的体细胞变异。在 IGV 中数据比对结果也显示,以 CC1 样本为例,在肿瘤组织 gDNA 中的 KRAS 和 AKT1 致病变异位点均有大量支持 reads,而其 cfDNA 的测序里,无论是否使用分子标签分析或是不同分析方法 (DS211 和 DS633),均未发现致病变异位点的支持reads (图2. A&B);以 CC2 样本为例,其 cfDNA 测序发现了与肿瘤组织 gDNA 中相一致的致病变异位点的支持 reads (图2. C&D)。我们推测这很可能与患者的病理分期有关。

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图2-01
图2-02
图2-03
图2-04


图2. CC1 和 CC2 样本突变分析一致性示例。

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cfDNA 的克隆性突变分析

仅靠 cfDNA 分析的突变结果可能是来源于白细胞的克隆性突变,从而对 ctDNA 的突变图谱造成干扰。我们选择将白细胞与癌旁组织进行配对分析,来评估可能的克隆性突变。理论上,白细胞的测序深度越高,就能越准确的将克隆性突变去除,但是也会造成测序成本的增加。本次分析中白细胞测序平均深度在 2,500x 左右,属于中小型 Panel 捕获测序可接受范围。

不过由于本次实验中 NanOnCT Panel 覆盖的常见克隆性突变基因较少,仅有 ATM,ALK,IDH1,IDH2,JAK2 和 TP53,3 个样本中,仅检测出 1 个 TP53-Y88C 突变 (表6. )。考虑到该突变仅在白细胞和 cfDNA 中检测到支持 reads,且 cfDNA 的丰度为白细胞突变丰度的 25%;同时肿瘤组织和癌旁组织中则无支持 reads (图3. )。由此可知 TP53-Y88C 突变为克隆性突变,应当从 cfDNA 突变分析结果中予以过滤。

表6. cfDNA 克隆性突变分析结果

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图3-05

图3. CC2 样本克隆性突变位点

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结束语

2019 年 MSK 和 Grail 共同发表文章研究结果表明,绝大部分克隆性造血的突变频率集中在0.1%~0.5%,可通过过滤算法减少其对 bTMB 判别带来的影响[1]。另外,早中期肿瘤患者的 MRD 检测需要借助基于高灵敏技术和超高深度的测序的方法检测低频变异位点,为了减少克隆性造血突变对 MRD 监测的不利影响,也需要白细胞的突变信息进行过滤[3-8]

在本文示例中,肿瘤 FFPE 组织及癌旁对照分析的结果,与肿瘤 FFPE 组织和白细胞对照分析结果一致,这说明克隆性造血突变对于肿瘤组织体细胞突变的检测影响很小。进一步的白细胞克隆性造血突变分析显示,CC2 样本存在一个 TP53 的克隆性造血突变且为潜在有害突变,应当予以过滤。

那么实际应用中是否一定要使用白细胞的超高深度测序来进行克隆性造血突变过滤呢?我们认为应根据不同的应用场景进行,如果是针对克隆性突变对患者进展和预后 (尤其是血液肿瘤) 的评估,那么应当进行以发现潜在的罕见克隆性造血突变;如果是常规临床 cfDNA 液体活检,则可结合生信算法的优化和数据库的积累,配以合适白细胞测序深度,即可去除克隆性造血突变的影响。

关于纳昂达科技

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纳昂达科技秉承“ Nano Trans More ”的核心理念和“靶向精准,用心服务诊断”的奋斗宗旨,致力于为科研院校、医疗机构、临检单位、产业公司、测序服务商等提供专业化和高质量的靶向测序产品与闭环解决方案。

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纳昂达专注于精准靶向试剂和配套自动化仪器的开发、生产、销售和服务,目前拥有 MGI 和 Illumina 双测序平台多款 NadPrep®文库构建试剂盒和全套液相杂交相关产品。明星产品包括 NGS 全流程自动化工作站、肿瘤全外显子 Panel、泛实体瘤和血液肿瘤 Panel 以及呼吸道病毒 Panel 等,并提供全面完善的双平台捕获探针定制化服务。纳昂达科技的靶向捕获产品拥有与国际同行业媲美的高质量水准,获得了客户一致的信赖。

纳昂达的销售网络覆盖全国并已外延至海外地区。纳昂达将与客户共成长,对客户的需求全力以赴,为全球用户提供靶向测序解决方案和 IVD 试剂原料。

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参考文献

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