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微小残留病灶 (Minimal residual disease, MRD)是肿瘤治疗后体内残留的微量肿瘤细胞的状态,也是肿瘤复发的主要原因。近些年,众多队列研究发现,得益于循环肿瘤DNA(Circulating Tumor DNA, ctDNA) 和肿瘤发病之间有着较强的相关性,MRD 技术在实体瘤术后监测中开始广泛应用。2022 年 ctDNA 监测更是首次写入了 CSCO 结直肠癌诊疗指南。此外 MRD 在新辅助治疗中的价值也日趋显著,今年 CheckMate-816[1]和另一项早期肺癌免疫联合化疗/双免的研究[2],均证实了以 ctDNA 动态监测为核心的 MRD 检测,能有效建立新辅助治疗与患者生存获益之间的联系,同时也证实清零患者具有更的病理完全缓解(Pathological Complete Remission,pCR)率。因此,MRD 检测技术也将逐渐从术后监测走向更前端的术前新辅助治疗,成为肿瘤治疗中全方位的监测手段。
2021年3月《肺癌 MRD 的检测和临床应用共识》指出基于 NGS 技术的 MRD 检测,其基本技术标准需稳定检出丰度 ≥0.02% 的 ctDNA。根据文中描述,“早期 NSCLC 患者血浆中位 cfDNA 浓度为7.69ng/ml,换算在10ml血浆中大概含有20000个单倍体基因组;考虑到 cfDNA 建库时的损耗以及至少存在2 条相同的变异基因序列,10 mL 血浆中 ctDNA 检测到的极限分子信号即为0.02%的水平。”
然而,实际情况远远要更加复杂。
首先,根据2018年发表于 Nature Reviews Clinical Oncology 的文章显示[3],205例早期 NSCLC 患者血浆中,64例血浆 cfDNA 浓度低于3.8ng/ml,换算在10ml血浆中大概含有10000个单倍体基因组;20例血浆 cfDNA 浓度低于1.9ng/ml,换算在10ml血浆中大概仅含有5000个单倍体基因组;对于中位浓度以上的多数样本,或者该论文中血浆 cfDNA 浓度为223.07ng/ml的血液样本,检出0.02%信号分子水平几乎没有太大难度(图1.)[3],但是对于血浆浓度仅为3.8ng/ml甚至更少的血浆样本而言,大大增加了检出难度。类似,在消化道肿瘤中,血液 cfDNA 浓度也呈现类似的规律。因此,相比高浓度血浆 cfDNA 样本,实现低浓度血浆 cfDNA 的样本才是攻克0.02%技术标准的关键难点。[4]
首先,根据2018年发表于 Nature Reviews Clinical Oncology 的文章显示[3],205例早期 NSCLC 患者血浆中,64例血浆 cfDNA 浓度低于3.8ng/ml,换算在10ml血浆中大概含有10000个单倍体基因组;20例血浆 cfDNA 浓度低于1.9ng/ml,换算在10ml血浆中大概仅含有5000个单倍体基因组;对于中位浓度以上的多数样本,或者该论文中血浆 cfDNA 浓度为223.07ng/ml的血液样本,检出0.02%信号分子水平几乎没有太大难度(图1.)[3],但是对于血浆浓度仅为3.8ng/ml甚至更少的血浆样本而言,大大增加了检出难度。类似,在消化道肿瘤中,血液 cfDNA 浓度也呈现类似的规律。因此,相比高浓度血浆 cfDNA 样本,实现低浓度血浆 cfDNA 的样本才是攻克0.02%技术标准的关键难点。[4]
图1.不同投入下单点 MAF 0.1%和 MAF 0.01%检出可能性。当cfDNA浓度大于100ng时,检出MAF 0.01% 单点的成功率为100%
其次,相比其他类型分子诊断监测技术,高通量测序技术具有更高的检测灵敏度优势。然而稳定检出单点也存在极限。2021年,美国FDA 领导的基因芯片/测序质控(MicroArray/Sequencing Quality Control,MAQC)协会在SEQC2项目中的循环肿瘤 DNA(ctDNA)靶向测序研究显示,即使采用独特的分子标签(Unique Molecular Identifiers,UMIs)进行错误纠正,VAF 0.5%以上具有较高的可重复性,但是在低于 VAF 0.5%的情况下,重复性有所下降(图2.)。
所以,敏感性是影响 MRD 稳定检测出的重要因素。
图2. 不同VAF(2.5–0.5%, 0.5–0.3%, 0.3–0.2% 0.2–0.1%)ctDNA检测灵敏度的性能表现
那么,应该如何做好 MRD ?可以从以下2个方面入手
第一,投入量有限,单点检测不够,可以通过增加检出位点数
当 cfDNA 的 VAF 值对应0.1%时,每管携带6个分子的概率会受到随机抽样的影响,换言之,检测单个 VAF 值对应0.1%的突变位点,很可能因为随机抽样概率学的因素而丢失。所以,TRACERx 采用18个 SNVs 检测 Panel 的方式,并以2个以上检出认定为阳性的方式达到实际样本的低频检出(图3.)[5]。类似的,Signature 公司在定制化检出检测 MRD 时则采用了16个位点的定制化方案进行 MRD 动态检测[6],这种方式也在某种意义上避免了随机抽样导致的单点检出成功率低的问题。
图3.增加基因数量,能大幅提升检出单点的概率
第二,一定数量可检位点,也可尝试进一步提升单点富集能力
SEQC2 项目中的循环肿瘤 DNA(ctDNA) 靶向测序研究证实了单点VAF小于0.5%以下的检出重复性会下降。这或许是已有捕获方法学的极限,因此从捕获方法学入手,提升目标区域富集能力则是另一个提高MRD阳性检出率的方法。
纳昂达近期推出了一款专门针对 MRD 小 Panel 捕获的产品 “μCaler”,与传统液相杂交捕获技术相比,该技术采用更短的捕获探针,结合设计上的特点,使探针与探针之间能产生共轭效应,从而能够加强相邻探针对目标区域的富集能力。
根据我们的内部测试数据发现,理论突变频率为 0.1% 和 0.01% 的位点,μCaler® Hyb 检测到的突变位点数量平均值分别为 18.3 和 3.7,而 Traditional Hyb 的检出分别为 16.0 和 3.5 (图4. A & C);理论突变频率为 0.05% 和 0.005% 的位点,μCaler Hyb 检测到的突变位点数量平均值分别为 9.3 和2.7,而 Traditional Hyb 检出分别为 8.0 和 2.0 (图5. B & D)。这表明 μCaler® Hyb 的单点富集能力均高于 Traditional Hyb。
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图4. 0.005%-1% 突变频率下,30 个模拟突变位点的检出分布
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图5. 0.005%-0.1% 突变频率下,30 个模拟突变位点的检出统计
注:Observed number of mutation 为 DCS211 分析模式下,不同突变频率检测到的平均突变位点数量;Theoretical number of mutation 为 2,750x 时,不同突变频率做 10000 次随机取样,突变检出频数的模拟分布。
03
订购信息
类别 |
货号 |
产品名称 |
规格详情 |
μCaler® MRD |
1100100 |
μCaler® MRD Solution (for Illumina®), 24rxn μCaler® MRD 解决方案 (Illumina平台),24反应 |
24 rxn |
UMI 接头 |
1103111 |
NadPrep® UMI Adapter Kit Set A1 (with 10 nt Index), 24 rxn |
24 rxn # 1-12 |
1103112 |
NadPrep® UMI Adapter Kit Set A2 (with 10 nt Index), 24 rxn |
24 rxn # 13-24 |
|
1103113 |
NadPrep® UMI Adapter Kit Set A3 (with 10 nt Index), 24 rxn |
24 rxn # 25-36 |
|
1103114 |
NadPrep® UMI Adapter Kit Set A4 (with 10 nt Index), 24 rxn |
24 rxn # 37-48 |
关于纳昂达科技
http://www.njnad.com/
纳昂达科技秉承“ Nano Trans More ”的核心理念和“靶向精准,用心服务诊断”的奋斗宗旨,致力于为科研院校、医疗机构、临检单位、产业公司、测序服务商等提供专业化和高质量的靶向测序产品与闭环解决方案。
纳昂达科技已通过高新技术企业、江苏省科技型中小企业和南京市精准高通量测序工程技术研究中心认定,并拥有 > 2,000 平米的高通量测序研发中心和 > 4,000 平米的GMP级别 (YY/T 0287-2017 idt ISO 13485:2016) 体外诊断试剂生产基地,建立了从市场调研、产品设计、生产制造到售后服务完整的质量管理体系。
纳昂达专注于精准靶向试剂和配套自动化仪器的开发、生产、销售和服务,目前拥有 MGI 和 Illumina 双测序平台多款 NadPrepⓇ 文库构建试剂盒和全套液相杂交相关产品。明星产品包括 NGS 全流程自动化工作站、肿瘤全外显子 Panel、泛实体瘤和血液肿瘤Panel以及呼吸道病毒 Panel 等,并提供全面完善的双平台捕获探针定制化服务。纳昂达科技的靶向捕获产品拥有与国际同行业媲美的高质量水准,获得了客户一致的信赖。
纳昂达的销售网络覆盖全国并已外延至海外地区。纳昂达将与客户共成长,对客户的需求全力以赴,为全球用户提供靶向测序解决方案和 IVD 试剂原料。
Nanodigmbio
电话:400 871 7699
邮箱:sales@njnad.com
网址:www.njnad.com
参考文献
[1] Forde P M, Spicer J, Lu S, et al. Neoadjuvant Nivolumab plus Chemotherapy in Resectable Lung Cancer[J]. The New England journal of medicine, 2022(21):386.
[2] Yue D, Liu W, Chen C, et al. Circulating tumor DNA predicts neoadjuvant immunotherapy efficacy and recurrence-free survival in surgical non-small cell lung cancer patients[J]. Translational Lung Cancer Research, 2022, 11(2):263-276.
[3] Christopher A, Birkbak N J, Charles S. Early stage NSCLC — challenges to implementing ctDNA-based screening and MRD detection[J]. Nature Reviews Clinical Oncology, 2018:1.
[4] Lan Y T, Chen M H, Fang W L, et al. Clinical relevance of cell-free DNA in gastrointestinal tract malignancy[J]. Oncotarget, 2016, 8(2).
[5] Heitzer E, Haque I S, Roberts C, et al. Current and future perspectives of liquid biopsies in genomics-driven oncology[J]. Nature reviews neuroscience, 2019(2):20.
[6] https://www.natera.com/oncology/signatera-advanced-cancer-detection/