μCaler® MRD Solution (for Illumina®)

货号：

#1100100
#1103111 #1103112 #1103113 #1103114

μCaler^® MRD Solution (for Illumina^®) 搭载含有双端分子标签 (Unique Molecular Identifier, UMI) 的接头，满足 MRD 检测应用对血浆游离 DNA 超低频突变的分析要求；此外，该解决方案专为小 Panel 的靶向富集而优化设计，搭载 μCaler^® Hybrid System，以及基于创新型方案设计的 μCaler^® Panel，能够在单日内完成捕获文库构建的全流程。
μCaler^® Panel 是基于纳昂达自主知识产权采取创新型方案设计推出的商品化或定制化 Panel (μCaler^® Custom Panel)，必须与 μCaler^®MRD Solution (for Illumina^®) 搭配使用，其能够在反应体系中快速寻找结合位置，多条探针结合目标区域后进一步稳固。

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μCaler^® Hybrid System 工作原理示意图

探针寻找靶标形成稳定结合

多条探针共轭效应快速结合进一步稳固

principle

产品特色

搭载分子标签接头，满足 MRD 对于低频突变分析的要求

快速杂交，单日内完成捕获文库构建的全流程

专门针对小 Panel 设计优化，具有出色稳定的捕获表现

实验流程简化升级，操作更便捷

产品表现

更快速

rapid

更稳定

不同样本类型及投入量

图 1. μCaler^® MRD Solution 对不同起始投入量的 cfDNA 和 gDNA 文库的捕获表现。A. 捕获数据比对率和捕获效率；B. 靶区域覆盖度；C. Fold 80 base penalty。健康人源混合 cfDNA 标准品和健康人类基因组 DNA (Promega，G1471) 利用 μCaler^® MRD Solution (for Illumina^®) 和 M71 (8.5 Kb, GC range 25-70%) 完成杂交捕获。利用 BWA 比对到参考基因组 hg38，On-target 按照 reads 数计算。测序模式为 Illumina Novaseq 6000，PE150。

不同类型 Panel

图 2. μCaler^® MRD Solution 对不同类型 Panel 的捕获表现。A. 捕获数据比对率和捕获效率；B. 靶区域覆盖度；C. Fold 80 base penalty。健康人类基因组 DNA (Promega，G1471) 利用 μCaler^® MRD Solution (for Illumina^®)，分别以 M27 (3.2 Kb, GC range 25-55%)、M44 (5.28 Kb, GC range 25-70%)、M50 (5 Kb, GC range 37-90%) 和 M580 (58 Kb, GC range 19-99%) 完成杂交捕获。利用 BWA 比对到参考基因组 hg38，On-target 按照 reads 数计算。测序模式为 Illumina Novaseq 6000，PE150。

标准品变异一致性分析

样本来源于泛肿瘤 800 gDNA 标准品 (Genewell, GW-OGTM800) 健康人类基因组 DNA (Promega, G1471) 分别按 10：0 和 1：9 混合，人工模拟不同突变频率。泛肿瘤 800 gDNA 标准品不同突变位点的理论突变频率如下：

图 3. μCaler® Panel 和 Traditional Panel 捕获数据中变异频率与标准品频率的一致性。30 ng 模拟样本利用 μCaler^® Hybrid System 和传统杂交捕获体系，分别以 μCaler® Panel 和 Traditional Panel 完成杂交捕获，DownSampling 每样本数据至去重前 80,000x 测序深度分析突变的检出一致性 (预文库含 UMI 分子标签)，分析过滤标准为单链一致性序列 (family size ≥ 3) (SSCS ≥ 3)。测序模式为 Illumina Novaseq 6000，PE150。

定制 SNP 组合模拟低频突变的极限检出

样本来源于 2 名健康捐献者的 gDNA 分别以 99：1、999：1 以及 9999：1 的比例混合，人工模拟不同突变频率。

图 4. μCaler® Panel 和 Traditional Panel 对低频突变的检出表现。50 ng 模拟样本利用 μCaler^® Hybrid System 和传统杂交捕获体系，分别以 μCaler^® Panel (~ 3 Kb target region，覆盖 30 个等位基因位点) 和 Traditional Panel (~ 42 Kb target region，覆盖 160 个等位基因位点，包含上述 30 个位点) 完成杂交捕获，3 次 Downsampling 每一对样本至同一深度 (预文库含 UMI 分子标签)，以双链一致性序列 (DCS211) 以及 SSCS ≥ 3 分析突变位点的检出情况。支持突变的平均有效 reads ≥1 判为阳性。测序模式为 Illumina Novaseq 6000，PE150。

图 5. μCaler^® Panel 和 Traditional Panel 对低频突变的检出及理论检出的比较分析。
注：Theoretical number of mutation 为 DCS211 深度 2,750x，不同突变频率做 10,000 次随机取样，突变检出的分布规律。

仅限研究使用，不用于临床诊断。

包装编号	子包装名称	管/瓶盖颜色	组分	包装体积
Box 1	文库构建 & 杂交		EndRepair & A-Tailing Buffer	100 μL
			EndRepair & A-Tailing Enzyme	65 μL
			Ligation Buffer	380 μL
			DNA ligase	65 μL
			2X HiFi PCR Master Mix	1450 μL
		/	Nuclease Free Water	4 mL
			TE Sloution	1000 μL
			μCaler NanoBlockers (for Illumina)	60 μL
			Human Cot DNA	60 μL
			μHyb #1	1100 μL
			μHyb #2	180 μL
			NadPrep Amplification Primer Mix II	75 μL
	UMI 接头		NadPrep UMI Adapter	60 μL
	UMI 接头		NadPrep Universal UDI-Index Primer Mix	12×15 μL
	定制探针		μCaler Custom Panel	60 μL
Box 2	洗脱	/	NadPrep SP beads	4 mL
			Streptavidin Beads	750 μL
		/	Wash Buffer A	2×8 mL
		/	Wash Buffer B	4.7 mL

使用 μCaler® 杂交捕获后文库产出过高的可能原因有哪些？该怎么解决？

可能原因	解决方案
起始投入量过量	建议使用 Qubit™ 3.0 进行定量
扩增循环数偏高	根据操作指南推荐摸索最佳扩增循环数
洗脱过程未按照操作指南进行，导致脱靶严重	洗脱过程严格按照操作指南要求进行操作

使用 μCaler® 杂交捕获后文库产出过低的可能原因有哪些？该怎么解决？

可能原因	解决方案
起始投入量不准确	实际起始投入量偏低，建议使用 qPCR 进行精确定量
转管时未将反应液全部转出	转管时务必将每一步的溶液全部转移至新的反应管
杂交以及磁珠纯化过程丢弃部分磁珠	洗脱过程操作避免过于剧烈，弃上清过程切勿丢失磁珠

使用 μCaler® 杂交捕获后中靶率低的可能原因有哪些？该如何解决？

可能原因	解决方案
洗脱过程产生大量气泡	移液器使用时需轻柔吹吸混匀，避免进入空气；若产生气泡，可先用移液器将液面上方气泡吸干净后再弃上清
未更换 PCR 管盖	严格按照说明书要求更换 PCR 管以及管盖
试剂未完全混匀	试剂使用前严格按照操作指南要求进行混匀，并置于相应的温度预热

μCaler® MRD Solution 如何实现 3 天极速交付？

依赖于自有核酸合成工厂的全流程精准把控，自接收 MRD 订单的第一天启动高通量全自动合成 Probe，第二天依次完成修饰合成、氨解、洗脱定量、质控 (若不符合质控标准，则同步启动重合)、分装等；第三天依次完成重合分装、抽干、分装及 Panel 生产和产品包装发货等；确保 3 个工作日内交付。

预文库低于 500 ng 是否可以进行杂交捕获？

可以。

利用 NadPrep® 系列试剂盒构建的预文库或第三方试剂盒构建的预文库是否可按照 μCaler® MRD Solution (for Illumina ®) 使用说明书进行杂交捕获及后续操作？

建议使用纳昂达全套系列产品。

μCaler® MRD Solution 生产是否依赖于进口，是否有断供的风险？

μCaler® MRD Solution 中核心组分均来源于国产，无需担心供货周期的问题。

杂交时间是否可以再缩短？

30 min- 16 hr 杂交捕获性能基本一致，推荐选择 1 hr 为最佳平衡。

如何提高 NGS 方案对于低频突变信号的检出率？

如何提高 NGS 方案对于低频突变信号的检出率？

① 增加样本投入量：样本起始量越多，支持低频突变检出的模板拷贝数越多；

② 增加跟踪突变数量：突变位点数量越高，检出概率越高。

注：a. 样本量越高，支持低频突变检出的模板拷贝数越高；b. 相同的样本量，突变位点数量越高，检出概率就会越高。

Abbosh C, Birkbak N J, Swanton C. Early stage NSCLC—challenges to implementing ctDNA-based screening and MRD detection[J]. Nature Reviews Clinical Oncology, 2018, 15(9): 577-586.
Van Der Pol Y, Mouliere F. Toward the early detection of cancer by decoding the epigenetic and environmental fingerprints of cell-free DNA[J]. Cancer cell, 2019, 36(4): 350-368.

如何实现 0.005% 的突变检出？

A：① 增加样本投入量
不同实验条件下对应的突变检测下限

文库转化率	样本起始量
文库转化率	1 ng	10 ng	20 ng	30 ng	50 ng	100 ng	200 ng	300 ng	500 ng	1000 ng
20%	5.000%	0.500%	0.250%	0.168%	0.100%	0.050%	0.025%	0.017%	0.010%	0.005%
30%	3.400%	0.340%	0.170%	0.113%	0.068%	0.034%	0.017%	0.011%	0.007%	0.003%
50%	2.000%	0.200%	0.100%	0.067%	0.040%	0.020%	0.010%	0.007%	0.004%	0.002%
100%	1.000%	0.100%	0.050%	0.033%	0.020%	0.010%	0.005%	0.003%	0.002%	0.001%

当文库转化率为 20% 时，投入 1000 ng 的样本可检出 0.005% 的突变；
当文库转化率为 50% 时，投入 400 ng 的样本可检出 0.005% 的突变；
② 增加突变位点数量

类别	产品名称	规格	货号
μCaler® MRD	μCaler® MRD Solution (for Illumina®), 24 rxn	24 rxn	1100100
UMI Adapter	NadPrep® UMI Adapter Kit Set A1 (with 10 nt Index), 24 rxn	# 1-12	1103111
	NadPrep® UMI Adapter Kit Set A2 (with 10 nt Index), 24 rxn	# 13-24	1103112
	NadPrep® UMI Adapter Kit Set A3 (with 10 nt Index), 24 rxn	# 25-36	1103113
	NadPrep® UMI Adapter Kit Set A4 (with 10 nt Index), 24 rxn	# 37-48	1103114