μCaler® MRD Solution (for Illumina®)
#1103111 #1103112 #1103113 #1103114
μCaler® Panel 是基于纳昂达自主知识产权采取创新型方案设计推出的商品化或定制化 Panel (μCaler® Custom Panel)，必须与 μCaler® MRD Solution (for Illumina®) 搭配使用，其能够在反应体系中快速寻找结合位置，多条探针结合目标区域后进一步稳固。
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μCaler® Hybrid System 工作原理示意图
- 探针寻找靶标形成稳定结合
- 多条探针共轭效应快速结合进一步稳固
产品特色
- 搭载分子标签接头，满足 MRD 对于低频突变分析的要求
- 快速杂交，单日内完成捕获文库构建的全流程
- 专门针对小 Panel 设计优化，具有出色稳定的捕获表现
- 实验流程简化升级，操作更便捷
产品表现
更快速
更稳定
不同样本类型及投入量
图 1. μCaler® MRD Solution 对不同起始投入量的 cfDNA 和 gDNA 文库的捕获表现。A. 捕获数据比对率和捕获效率；B. 靶区域覆盖度；C. Fold 80 base penalty。健康人源混合 cfDNA 标准品和健康人类基因组 DNA (Promega，G1471) 利用 μCaler® MRD Solution (for Illumina®) 和 M71 (8.5 Kb, GC range 25-70%) 完成杂交捕获。利用 BWA 比对到参考基因组 hg38，On-target 按照 reads 数计算。测序模式为 Illumina Novaseq 6000，PE150。
不同类型 Panel
图 2. μCaler® MRD Solution 对不同类型 Panel 的捕获表现。A. 捕获数据比对率和捕获效率；B. 靶区域覆盖度；C. Fold 80 base penalty。健康人类基因组 DNA (Promega，G1471) 利用 μCaler® MRD Solution (for Illumina®)，分别以 M27 (3.2 Kb, GC range 25-55%)、M44 (5.28 Kb, GC range 25-70%)、M50 (5 Kb, GC range 37-90%) 和 M580 (58 Kb, GC range 19-99%) 完成杂交捕获。利用 BWA 比对到参考基因组 hg38，On-target 按照 reads 数计算。测序模式为 Illumina Novaseq 6000，PE150。
标准品变异一致性分析
样本来源于泛肿瘤 800 gDNA 标准品 (Genewell, GW-OGTM800) 健康人类基因组 DNA (Promega, G1471) 分别按 10：0 和 1：9 混合，人工模拟不同突变频率。泛肿瘤 800 gDNA 标准品不同突变位点的理论突变频率如下：
图 3. μCaler® Panel 和 Traditional Panel 捕获数据中变异频率与标准品频率的一致性。30 ng 模拟样本利用 μCaler® Hybrid System 和传统杂交捕获体系， 分别以 μCaler® Panel 和 Traditional Panel 完成杂交捕获，DownSampling 每样本数据至去重前 80,000x 测序深度分析突变的检出一致性 (预文库含 UMI 分子标签)，分析过滤标准为单链一致性序列 (family size ≥ 3) (SSCS ≥ 3)。测序模式为 Illumina Novaseq 6000，PE150。
定制 SNP 组合模拟低频突变的极限检出
样本来源于 2 名健康捐献者的 gDNA 分别以 99：1、999：1 以及 9999：1 的比例混合，人工模拟不同突变频率。
图 4. μCaler® Panel 和 Traditional Panel 对低频突变的检出表现。50 ng 模拟样本利用 μCaler® Hybrid System 和传统杂交捕获体系， 分别以 μCaler® Panel (~ 3 Kb target region，覆盖 30 个等位基因位点) 和 Traditional Panel (~ 42 Kb target region，覆盖 160 个等位基因位点，包含上述 30 个位点) 完成杂交捕获，3 次 Downsampling 每一对样本至同一深度 (预文库含 UMI 分子标签)，以双链一致性序列 (DCS211) 以及 SSCS ≥ 3 分析突变位点的检出情况。支持突变的平均有效 reads ≥1 判为阳性。测序模式为 Illumina Novaseq 6000，PE150。
图 5. μCaler® Panel 和 Traditional Panel 对低频突变的检出及理论检出的比较分析。
注：Theoretical number of mutation 为 DCS211 深度 2,750x，不同突变频率做 10,000 次随机取样，突变检出的分布规律。
| 包装编号 | 子包装名称 | 管/瓶盖颜色 | 组分 | 包装体积 |
| Box 1 | 文库构建 & 杂交 |
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EndRepair & A-Tailing Buffer | 100 μL |
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EndRepair & A-Tailing Enzyme | 65 μL | ||
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Ligation Buffer | 380 μL | ||
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DNA ligase | 65 μL | ||
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2X HiFi PCR Master Mix | 1450 μL | ||
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/ |
Nuclease Free Water | 4 mL | ||
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TE Sloution | 1000 μL | ||
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μCaler NanoBlockers (for Illumina) | 60 μL | ||
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Human Cot DNA | 60 μL | ||
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μHyb #1 | 1100 μL | ||
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μHyb #2 | 180 μL | ||
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NadPrep Amplification Primer Mix II | 75 μL | ||
| UMI 接头 |
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NadPrep UMI Adapter | 60 μL | |
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NadPrep Universal UDI-Index Primer Mix | 12×15 μL | ||
| 定制探针 |
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μCaler Custom Panel | 60 μL | |
| Box 2 | 洗脱 |
/ |
NadPrep SP beads | 4 mL |
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Streptavidin Beads | 750 μL | ||
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/ |
Wash Buffer A | 2×8 mL | ||
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/ |
Wash Buffer B | 4.7 mL |
|
可能原因 |
解决方案 |
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起始投入量过量 |
建议使用 Qubit™ 3.0 进行定量 |
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扩增循环数偏高 |
根据操作指南推荐摸索最佳扩增循环数 |
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洗脱过程未按照操作指南进行，导致脱靶严重 |
洗脱过程严格按照操作指南要求进行操作 |
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可能原因 |
解决方案 |
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起始投入量不准确 |
实际起始投入量偏低，建议使用 qPCR 进行精确定量 |
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转管时未将反应液全部转出 |
转管时务必将每一步的溶液全部转移至新的反应管 |
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杂交以及磁珠纯化过程丢弃部分磁珠 |
洗脱过程操作避免过于剧烈，弃上清过程切勿丢失磁珠 |
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可能原因 |
解决方案 |
|
洗脱过程产生大量气泡 |
移液器使用时需轻柔吹吸混匀，避免进入空气；若产生气泡，可先用移液器将液面上方气泡吸干净后再弃上清 |
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未更换 PCR 管盖 |
严格按照说明书要求更换 PCR 管以及管盖 |
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试剂未完全混匀 |
试剂使用前严格按照操作指南要求进行混匀，并置于相应的温度预热 |
如何提高 NGS 方案对于低频突变信号的检出率？
① 增加样本投入量：样本起始量越多，支持低频突变检出的模板拷贝数越多；
② 增加跟踪突变数量：突变位点数量越高，检出概率越高。
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Van Der Pol Y, Mouliere F. Toward the early detection of cancer by decoding the epigenetic and environmental fingerprints of cell-free DNA[J]. Cancer cell, 2019, 36(4): 350-368.
不同实验条件下对应的突变检测下限
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文库转化率 |
样本起始量 |
|||||||||
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1 ng |
10 ng |
20 ng |
30 ng |
50 ng |
100 ng |
200 ng |
300 ng |
500 ng |
1000 ng |
|
|
20% |
5.000% |
0.500% |
0.250% |
0.168% |
0.100% |
0.050% |
0.025% |
0.017% |
0.010% |
0.005% |
|
30% |
3.400% |
0.340% |
0.170% |
0.113% |
0.068% |
0.034% |
0.017% |
0.011% |
0.007% |
0.003% |
|
50% |
2.000% |
0.200% |
0.100% |
0.067% |
0.040% |
0.020% |
0.010% |
0.007% |
0.004% |
0.002% |
|
100% |
1.000% |
0.100% |
0.050% |
0.033% |
0.020% |
0.010% |
0.005% |
0.003% |
0.002% |
0.001% |
当文库转化率为 50% 时，投入 400 ng 的样本可检出 0.005% 的突变；
② 增加突变位点数量
| 类别 | 产品名称 | 规格 | 货号 |
| μCaler® MRD | μCaler® MRD Solution (for Illumina®), 24 rxn | 24 rxn | 1100100 |
| UMI Adapter | NadPrep® UMI Adapter Kit Set A1 (with 10 nt Index), 24 rxn | # 1-12 | 1103111 |
| NadPrep® UMI Adapter Kit Set A2 (with 10 nt Index), 24 rxn | # 13-24 | 1103112 | |
| NadPrep® UMI Adapter Kit Set A3 (with 10 nt Index), 24 rxn | # 25-36 | 1103113 | |
| NadPrep® UMI Adapter Kit Set A4 (with 10 nt Index), 24 rxn | # 37-48 | 1103114 |
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