标准品变异一致性分析
样本来源于泛肿瘤 800 gDNA 标准品 (Genewell, GW-OGTM800) 健康人类基因组 DNA (Promega, G1471) 分别按 10:0 和 1:9 混合,人工模拟不同突变频率。泛肿瘤 800 gDNA 标准品不同突变位点的理论突变频率如下:
图 3. μCaler® Panel 和 Traditional Panel 捕获数据中变异频率与标准品频率的一致性。30 ng 模拟样本利用 μCaler® Hybrid System 和传统杂交捕获体系, 分别以 μCaler® Panel 和 Traditional Panel 完成杂交捕获,DownSampling 每样本数据至去重前 80,000x 测序深度分析突变的检出一致性 (预文库含 UMI 分子标签),分析过滤标准为单链一致性序列 (family size ≥ 3) (SSCS ≥ 3)。测序模式为 Illumina Novaseq 6000,PE150。
定制 SNP 组合模拟低频突变的极限检出
样本来源于 2 名健康捐献者的 gDNA 分别以 99:1、999:1 以及 9999:1 的比例混合,人工模拟不同突变频率。
图 4. μCaler® Panel 和 Traditional Panel 对低频突变的检出表现。50 ng 模拟样本利用 μCaler® Hybrid System 和传统杂交捕获体系, 分别以 μCaler® Panel (~ 3 Kb target region,覆盖 30 个等位基因位点) 和 Traditional Panel (~ 42 Kb target region,覆盖 160 个等位基因位点,包含上述 30 个位点) 完成杂交捕获,3 次 Downsampling 每一对样本至同一深度 (预文库含 UMI 分子标签),以双链一致性序列 (DCS211) 以及 SSCS ≥ 3 分析突变位点的检出情况。支持突变的平均有效 reads ≥1 判为阳性。测序模式为 Illumina Novaseq 6000,PE150。
图 5. μCaler® Panel 和 Traditional Panel 对低频突变的检出及理论检出的比较分析。
注:Theoretical number of mutation 为 DCS211 深度 2,750x,不同突变频率做 10,000 次随机取样,突变检出的分布规律。
包装编号 | 子包装名称 | 管/瓶盖颜色 | 组分 | 包装体积 |
Box 1 | 文库构建 & 杂交 |
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EndRepair & A-Tailing Buffer | 100 μL |
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EndRepair & A-Tailing Enzyme | 65 μL | ||
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Ligation Buffer | 380 μL | ||
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DNA ligase | 65 μL | ||
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2X HiFi PCR Master Mix | 1450 μL | ||
/ |
Nuclease Free Water | 4 mL | ||
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TE Sloution | 1000 μL | ||
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μCaler NanoBlockers (for Illumina) | 60 μL | ||
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Human Cot DNA | 60 μL | ||
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μHyb #1 | 1100 μL | ||
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μHyb #2 | 180 μL | ||
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NadPrep Amplification Primer Mix II | 75 μL | ||
UMI 接头 |
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NadPrep UMI Adapter | 60 μL | |
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NadPrep Universal UDI-Index Primer Mix | 12×15 μL | ||
定制探针 |
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μCaler Custom Panel | 60 μL | |
Box 2 | 洗脱 |
/ |
NadPrep SP beads | 4 mL |
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Streptavidin Beads | 750 μL | ||
/ |
Wash Buffer A | 2×8 mL | ||
/ |
Wash Buffer B | 4.7 mL |
可能原因 |
解决方案 |
起始投入量过量 |
建议使用 Qubit™ 3.0 进行定量 |
扩增循环数偏高 |
根据操作指南推荐摸索最佳扩增循环数 |
洗脱过程未按照操作指南进行,导致脱靶严重 |
洗脱过程严格按照操作指南要求进行操作 |
可能原因 |
解决方案 |
起始投入量不准确 |
实际起始投入量偏低,建议使用 qPCR 进行精确定量 |
转管时未将反应液全部转出 |
转管时务必将每一步的溶液全部转移至新的反应管 |
杂交以及磁珠纯化过程丢弃部分磁珠 |
洗脱过程操作避免过于剧烈,弃上清过程切勿丢失磁珠 |
可能原因 |
解决方案 |
洗脱过程产生大量气泡 |
移液器使用时需轻柔吹吸混匀,避免进入空气;若产生气泡,可先用移液器将液面上方气泡吸干净后再弃上清 |
未更换 PCR 管盖 |
严格按照说明书要求更换 PCR 管以及管盖 |
试剂未完全混匀 |
试剂使用前严格按照操作指南要求进行混匀,并置于相应的温度预热 |
如何提高 NGS 方案对于低频突变信号的检出率?
① 增加样本投入量:样本起始量越多,支持低频突变检出的模板拷贝数越多;
② 增加跟踪突变数量:突变位点数量越高,检出概率越高。
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文库转化率 |
样本起始量 |
|||||||||
1 ng |
10 ng |
20 ng |
30 ng |
50 ng |
100 ng |
200 ng |
300 ng |
500 ng |
1000 ng |
|
20% |
5.000% |
0.500% |
0.250% |
0.168% |
0.100% |
0.050% |
0.025% |
0.017% |
0.010% |
0.005% |
30% |
3.400% |
0.340% |
0.170% |
0.113% |
0.068% |
0.034% |
0.017% |
0.011% |
0.007% |
0.003% |
50% |
2.000% |
0.200% |
0.100% |
0.067% |
0.040% |
0.020% |
0.010% |
0.007% |
0.004% |
0.002% |
100% |
1.000% |
0.100% |
0.050% |
0.033% |
0.020% |
0.010% |
0.005% |
0.003% |
0.002% |
0.001% |
类别 | 产品名称 | 规格 | 货号 |
μCaler® MRD | μCaler® MRD Solution (for Illumina®), 24 rxn | 24 rxn | 1100100 |
UMI Adapter | NadPrep® UMI Adapter Kit Set A1 (with 10 nt Index), 24 rxn | # 1-12 | 1103111 |
NadPrep® UMI Adapter Kit Set A2 (with 10 nt Index), 24 rxn | # 13-24 | 1103112 | |
NadPrep® UMI Adapter Kit Set A3 (with 10 nt Index), 24 rxn | # 25-36 | 1103113 | |
NadPrep® UMI Adapter Kit Set A4 (with 10 nt Index), 24 rxn | # 37-48 | 1103114 |
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