新品上线 | 搭载全新 BS 转化模块的甲基化捕获测序方案
01 背景
表观遗传变化越来越被认为是癌症发生和进展的主要驱动因素之一，其主要通过 DNA 甲基化、组蛋白修饰、非编码 RNA 调控和染色体结构重构等方式对基因功能和表达水平进行调控。恶性肿瘤细胞常表现出明显的甲基化模式变化，包括位于基因启动子的基因组的整体水平的低甲基化和 CpG 岛局部的高甲基化[1]。因此，DNA 甲基化可以作为一种稳定的肿瘤标志物，应用于肿瘤早筛和早诊中。例如，血浆中 SEPT9 基因的甲基化状态检测已经被广泛应用于结直肠癌的早期筛查和诊断[2-5]；此外，通过检测血浆、肺泡灌洗液或痰液中 SHOX2、p16 等基因的甲基化状态可以实现肺癌的早期诊断和预后评估[6-7]。目前，北京已将基因甲基化检测纳入甲类医保服务项目及甲类工伤保险项目；同时，多款基因甲基化检测产品也被纳入海南医保价格目录。
图 1. 肿瘤抑制基因的 CpG 岛高甲基化导致其蛋白表达失活和癌症的发生[8]
全基因组甲基化测序采用亚硫酸氢盐 (Bisulfite，以下简称为“BS”) 处理基因组 DNA，将非甲基化的胞嘧啶 (C) 转化为尿嘧啶 (U) [9]，这种方法巧妙地将“修饰信息”转化为“碱基信息”，从而区分 DNA 的甲基化状态。由于其转化率高 (＞ 99%)、重复性好且易于通过商业试剂盒获得，因此，该技术一直被作为 DNA 甲基化测序的“金标准”。结合高通量测序技术，可以大规模的以单碱基分辨率分析基因组甲基化状态。但是，针对整个基因组进行分析仍然存在成本和效率方面的限制，而靶向富集技术的引入，降低了测序成本，提高了目标区域的测序深度，使得甲基化定向分析的效率大为提高。
纳昂达针对 MGI 及 Illumina 测序平台提供甲基化靶向富集 NGS 整体解决方案，包括：基于亚硫酸氢盐或酶转化的甲基化测序文库构建试剂盒，亚硫酸氢盐转化模块，针对转化后文库的液相杂交捕获探针设计及合成服务、液相杂交捕获体系及甲基化靶向富集 NGS 自动化分析平台，旨在帮助研究人员快速、准确地分析基因组的甲基化状态，为相关疾病的研究和临床诊断提供支持。
02 基于 BS 转化的甲基化检测
目前市面上基于 BS 原理的转化试剂盒一般采用柱纯化的方式进行纯化回收；然而，柱内吸附剂的吸附效果易受到样品流速和浓度的影响，极大地导致样本损失；此外，离心步骤需重复换管，操作流程较为繁琐，且该方法无法兼容自动化工作平台。因此，纳昂达推出了 NadPrep® DNA Methyl Bisulfite Conversion Module，基于磁珠纯化的方案，使之能够兼容自动化工作站。同时在转化反应添加了保护剂，既确保完全转化，又降低了转化损伤的发生。
NadPrep® DNA Methyl Bisulfite Conversion Module 基于磁珠纯化的方案可在 2 hr 内将未甲基化的胞嘧啶高效转化为尿嘧啶，且利于自动化开展。该转化模块可衔接纳昂达 NadPrep® 双链和单链甲基化文库构建方案以及第三方文库构建试剂盒，同时支持在多种类型的起始样本中灵活选择。本试剂盒提供 DNA 保护剂可维持 DNA 单链状态有利于提升复杂区域的转化效率，保证稳定高效。
图 2. WGBS 文库构建全流程解决方案
03 产品特色
3.1
操作便捷利于自动化开展
室温即用型 (Box 1 10~30℃/ Box 2 2~8℃)
基于磁珠纯化的方案，避免多次转管，便于批量转化且兼容自动化平台
3.2
效期长，用户友好型
提供易于保存的粉剂和溶剂以配制新鲜的转化试剂，有效提升存储周期
新鲜配制的转化试剂支持多次开盖 (推荐不超过 3 次) 且不影响产品基本性能表现
图 3.极限投入量下在经过不同开盖次数的转化试剂的建库表现。A. 文库产出；B. 转化率。
图 4. 产品组成
3.3
兼容多类型样本且支持宽泛的投入量范围
支持 10-1000 ng 投入
兼容 gDNA、cfDNA、FFPE DNA 等多类型样本
3.4
转化率高效稳定
保护剂维持 DNA 单链状态以提升复杂区域的转化率
变性与转化循环进行确保转化完全且降低损伤
胞嘧啶转化率稳定 ＞ 99%
04 产品表现
4.1
双链甲基化文库构建方案
4.1.1 不同投入量下的文库产出及转化率
人类男性基因组 DNA 标准品 (Promega, G1471) 利用 NadPrep® Methyl Library Preparation Module 搭配 NadPrep® Methyl Stubby Adapter (UDI) Module (with 10 nt Index) 和 NadPrep® DNA Methyl Bisulfite Conversion Module 构建全基因组甲基化文库。结果显示，不同投入量 (10-1000 ng) 下的文库产出与 Lambda DNA CpG 转化率均保持稳定；其中，不同投入量转化率均 ＞ 99.3%。
图 5. 不同投入量样本的文库产出及转化率。A. 文库产出；B. Lambda DNA CpG 转化率。测序模式：Illumina Novaseq 6000，PE 150 测序。
4.1.2 捕获表现比较分析
以人甲基化阳性对照 (Methylated DNA, Zymo, D5014-2) 与阴性对照 (Non-Methylated DNA, Zymo, D5014-1) 按不同比例混合，以模拟不同甲基化水平的样本。50 ng模拟样本利用 纳昂达双链甲基化文库构建试剂盒分别搭配 NadPrep® DNA Methyl Bisulfite Conversion Module (NadPrep®)、Vendor Q* 和 Vendor Z* 转化模块构建文库，以甲基化 Demo Panel (60 K) 进行杂交捕获，downsampling 0.3 G 数据用于后续分析。结果显示，NadPrep® 和Vendor Q* 在各方面表现均较为接近：On-target rate ＞ 96.6%，0.2x Mean ＞ 99.9%，0.5x Mean ＞ 96.5%，Fold 80 维持在 1.2 左右，去重后测序深度 ＞1091.8x。
图 6. 不同甲基化水平样本的捕获表现。A. 捕获数据比对率和中靶率；B. 靶区域覆盖度；C. Fold 80 base penalty；D. 去重后测序深度。测序模式：Illumina Novaseq 6000，PE 150 测序。On-target 按照 reads 数计算。
4.1.3 甲基化水平准确率
比较分析模拟样本的理论甲基化水平与实际检测到的甲基化水平，以此来评估甲基化水平准确率；结果显示，不同甲基化水平的检测值与模拟比例值基本一致；总体来说，不论是 0%，50% 还是 100%，NadPrep® 更接近于模拟理论值。
图 7. 不同甲基化水平样本的甲基化靶向测序表现。A. 理论甲基化水平与实际检测到的甲基化水平的比较；B. 靶区域 CpG 甲基化水平。
4.2
单链甲基化文库构建方案
4.2.1 建库表现
20 ng人类男性基因组 DNA 标准品 (Promega, G1471) 利用第三方单链甲基化文库构建模块，分别搭配 NadPrep® 和 Vendor Z* 转化模块 (第三方试剂盒推荐搭配)，构建单链甲基化文库。结果显示，NadPrep® 与 Vendor Z* 的文库产出和 Lambda DNA CpG 转化率均处于同一水平；而 NadPrep® 转化模块对样本的转化损伤较低，具有更高的覆盖均一性，高 GC 区域覆盖度更优，能够保留更多的有效文库信息。
图 8. 单链甲基化文库构建方案的建库表现。A. 文库产出；B. Lambda DNA CpG 转化率；C. GC 偏好性。
4.2.2 捕获表现
此外，200 ng/pre-library (1 plex) 投入，以甲基化 Demo Panel (60 K) 进行杂交捕获，downsampling 0.3 G 数据用于后续分析。结果显示，搭配使用 NadPrep® 转化模块的靶区域覆盖度表现更优 (0.2x Mean ＞ 98% 且 0.5x Mean ＞ 85%)；而搭配使用 Vendor Z* 转化模块的 0.2x Mean 在 80% 左右，0.5x Mean 在 60% 左右；同样，与全基因组甲基化文库表现一致：NadPrep® 转化模块在高 GC 区域覆盖度明显优于 Vendor Z*。由此可见，NadPrep® 转化模块的单链建库方案的整体表现优于 Vendor Z*。
图 9. 单链甲基化文库构建方案的捕获表现。A. 捕获数据比对率和中靶率；B. 靶区域覆盖度；C. 去重后测序深度；D. GC 偏好性。
纳昂达基于 BS 转化的甲基化捕获测序整体解决方案适用不同类型样本的转化，兼容双链和单链甲基化文库构建方案，基于磁珠的纯化方案更有利于自动化开展。同时，整体方案能够提高复杂区域的转化率并降低高 GC 区域的转化损伤，在高 GC 区域具有更优的覆盖度表现。
新品预告
纳昂达单链甲基化文库构建模块将于近期开放试用，欢迎咨询~~~
05 订购信息
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产品名称 |
货号 |
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NadPrep® DNA Methyl Bisulfite Conversion Module, 24 rxn |
1002701 |
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NadPrep® DNA Methyl Bisulfite Conversion Module, 96 rxn |
1002702 |
参考文献
[1] Pfeifer G P. Defining driver DNA methylation changes in human cancer[J]. International journal of molecular sciences, 2018, 19(4): 1166.
[2] Summers T, Langan R C, Nissan A, et al. Serum-based DNA methylation biomarkers in colorectal cancer: potential for screening and early detection[J]. Journal of Cancer, 2013, 4(3): 210.
[3] Xie L, Jiang X, Li Q, et al. Diagnostic value of methylated Septin9 for colorectal cancer detection[J]. Frontiers in oncology, 2018, 8: 247.
[4] Payne S R. From discovery to the clinic: the novel DNA methylation biomarker m SEPT9 for the detection of colorectal cancer in blood[J]. Epigenomics, 2010, 2(4): 575-585.
[5] Zhao G, Liu X, Liu Y, et al. Aberrant DNA methylation of SEPT9 and SDC2 in stool specimens as an integrated biomarker for colorectal cancer early detection[J]. Frontiers in Genetics, 2020, 11: 643.
[6] An Q, Liu Y, Gao Y, et al. Detection of p16 hypermethylation in circulating plasma DNA of non-small cell lung cancer patients[J]. Cancer letters, 2002, 188(1-2): 109-114.
[7] Ren M, Wang C, Sheng D, et al. Methylation analysis of SHOX2 and RASSF1A in bronchoalveolar lavage fluid for early lung cancer diagnosis[J]. Annals of diagnostic pathology, 2017, 27: 57-61.
[8] Ebrahimi V, Soleimanian A, Ebrahimi T, et al. Epigenetic modifications in gastric cancer: Focus on DNA methylation[J]. Gene, 2020, 742: 144577.
[9] Hayatsu H, Negishi K, Shiraishi M. DNA methylation analysis: speedup of bisulfite-mediated deamination of cytosine in the genomic sequencing procedure[J]. Proceedings of the Japan Academy, Series B, 2004, 80(4): 189-194.
