新品上线 | 基于 μCaler 杂交捕获富集系统的热点突变检测 Panel 重磅问世！
01 背景
根据世界卫生组织国际癌症研究机构 (IARC) 发布的 2021 年全球最新癌症负担数据：全球新发癌症病例 1970 万，全球癌症死亡病例 950 万；中国新发癌症病例 499 万，中国癌症死亡病例 327 万，分占全球的 25.33% 和 34.42%[1]。癌症已经成为全球第二大死亡原因，造成了六分之一的死亡，其已成为 21 世纪全球最具有挑战性的公共卫生问题之一。不过，目前的科学证据表明，几乎所有癌症，如果能在早期被发现、诊断和治疗，生存率机会将大大增加。
随着人类对疾病认识的不断加深，肿瘤的治疗模式也在发生变革，在“精准医疗”的大环境下，个体化精准治疗模式逐渐成为主流。随着基因检测技术的快速进步以及多学科交叉应用的发展和一系列药物临床研究的突破，近年来新发现的肿瘤驱动基因不断增多，推动了癌症靶向治疗药物的研发和临床应用[2]。
02 热点突变检测
热点 (HotSpot) 突变通常指基因序列中突变几率较高的碱基。热点突变可能会导致蛋白质功能改变或失调，从而影响生物体的正常生长和发育，进而导致癌症等疾病的发生。与正选择相关的热点突变常在癌症驱动基因中累积，如 BRAF 中的 V600E 突变，EGFR 中的 L858R 突变，常被称为“驱动热点突变”；一些特定的热点突变经常出现在特定的肿瘤中，但与癌症的发生和进展无关，被称之为“乘客热点突变”[3-6]。
在癌症研究和诊疗中，热点突变检测的意义在于能够在临床上对不同亚型的肿瘤进行准确的分类和诊断，从而为患者提供更好的个体化治疗方案；此外，某些热点突变与肿瘤的生长、转移和治疗反应有关，例如：BRAF V600E 突变与恶性黑色素瘤的不良预后[7]、EGFR L858R 突变与非小细胞肺癌的靶向治疗反应[8]等。热点突变检测可以帮助预测患者的治疗效果和预后，并及时调整治疗方案。同时，通过对热点突变的检测和分析，可以更深入地了解肿瘤发生的分子机制，有助于研究人员开发新的靶向治疗方法和药物，提升肿瘤治疗的效果，提高患者的生存率和生活质量。
因此，纳昂达推出 μCaler® HotSpot Panel v1.0 搭载 μCaler® 杂交捕获富集系统，能够在提高实验效率的同时保证小靶区捕获的稳定性，为一些常见癌症的临床研究及应用手段提供支持。
03 产品简介
μCaler® HotSpot Panel v1.0 靶向肿瘤突变“热点”区域，精选了包括结直肠癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、甲状腺癌、黑色素瘤等在内的与致癌和肿瘤抑制相关的 49 个热点突变基因，涵盖了 COSMIC 数据库中 2585 个已知癌症突变，探针覆盖基因组约 25 Kb 区域。
该 Panel 搭配 μCaler® Hybrid Capture Reagents 及 μCaler® NanoBlcokers 使用。基于全新的 μCaler® 杂交捕获富集系统，μCaler® HotSpot Panel v1.0 提升了捕获效率，捕获表现稳定优异且显著减少操作步骤，大幅度缩短实验时间和降低实验操作难度，实现更高效的测序并节省成本。
04 产品表现
4.1 优异的捕获性能
μCaler® HotSpot Panel v1.0 搭配 μCaler® 杂交捕获富集系统使用，其以极为快速和简便的实验流程，为小靶区的富集提供了优异的捕获性能。μCaler® HotSpot Panel v1.0 覆盖基因组约 25 Kb 区域，中靶率可达到 70% 以上；0.2x 平均覆盖深度均高于 99.3%，0.5x 平均覆盖深度均高于 88.4%。
图 1. μCaler® HotSpot Panel v1.0 的捕获表现。100 ng 人类男性基因 DNA 标准品 (Promega，G1471) 和 OncoOne 泛肿瘤 gDNA 标准品 (LDT Bioscience， LDT900)，利用 NadPrep® 快速 DNA 酶切文库构建试剂盒 v2 进行预文库构建。500 ng/预文库投入，参照 μCaler® 杂交捕获指南。利用 BWA 比对到参考基因组 hg38，On-target 按照 reads 数计算。A. 捕获数据的中靶率、比对率；B. 靶区域覆盖度；C. 靶区域覆盖均一性。
注：测序模式为 Illumina Novaseq 6000，PE150。
4.2 标准品变异一致性分析
单核苷酸多态性 (SNP) 和插入缺失 (InDel) 是基因组变异的常见来源，也是引起人类疾病的重要原因。我们选用了OncoOne 泛肿瘤 gDNA 标准品 (LDT Bioscience，LDT900) 用以评估分析 μCaler® HotSpot Panel v1.0 的变异频率检出的一致性。LDT900 包含了肺癌、肝癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌等癌种在内的多种热点突变类型，涵盖 SNP、InDel、CNV、Fusion，且经过 ddPCR 与 WES 双验证。结果显示，μCaler® HotSpot Panel v1.0 捕获数据中变异频率与标准品提供的参考值基本一致。
图 2. μCaler® HotSpot Panel v1.0 捕获数据中变异频率与标准品频率的一致性。利用 NadPrep® 快速 DNA 酶切文库构建试剂盒 v2 构建预文库，以μCaler® HotSpot Panel v1.0完成杂交捕获，Vardict 1.5.1 进行变异分析。测序模式：Illumina Novaseq 6000，PE150。
注：样本为人类男性基因组 DNA 标准品 (Promega，G1471) 和 OncoOne 泛肿瘤 gDNA 标准品 (LDT Bioscience，LDT900)。
4.3 靶标基因拷贝数分析
μCaler® HotSpot Panel v1.0 针对热点区域设计，但是对于基因的拷贝数变化，仍然能够如实反映。图3. 中选取了靶区个数大于 2 的基因，以平均相对覆盖深度计算基因拷贝数；其中 MET 为 4 拷贝，与参考值一致。
图 3. μCaler® HotSpot Panel v1.0 对标准品样本的拷贝数变异分析。利用 NadPrep® 快速 DNA 酶切文库构建试剂盒 v2 构建预文库，以 μCaler® HotSpot Panel v1.0 完成杂交捕获。测序模式：Illumina Novaseq 6000，PE150。
注：样本为OncoOne 泛肿瘤 gDNA 标准品 (LDT Bioscience，LDT900)。
05 订购信息
产品名称
货号
μCaler® HotSpot Panel v1.0, 96 rxn
1101401
μCaler® HotSpot Panel v1.0, 16 rxn
1101402
参考文献
[1] https://www.who.int/zh/news-room/fact-sheets/detail/cancer
[2] 二代测序技术在NSCLC中的临床应用中国专家共识(2020版).
[3] Bergstrom E N, Luebeck J, Petljak M, et al. Mapping clustered mutations in cancer reveals APOBEC3 mutagenesis of ecDNA[J]. Nature, 2022, 602(7897): 510-517.
[4] Trevino V. Modeling and analysis of site-specific mutations in cancer identifies known plus putative novel hotspots and bias due to contextual sequences[J]. Computational and Structural Biotechnology Journal, 2020, 18: 1664-1675.
[5] Loo E, Khalili P, Beuhler K, et al. BRAF V600E mutation across multiple tumor types: correlation between DNA-based sequencing and mutation-specific immunohistochemistry[J]. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology, 2018, 26(10): 709-713.
[6] Hess J M, Bernards A, Kim J, et al. Passenger hotspot mutations in cancer[J]. Cancer Cell, 2019, 36(3): 288-301. e14.
[7] Long G V, Menzies A M, Nagrial A M, et al. Prognostic and clinicopathologic associations of oncogenic BRAF in metastatic melanoma[J]. Journal of Clinical Oncology, 2011, 29(10): 1239-1246.
[8] Paez J G, Janne P A, Lee J C, et al. EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy[J]. Science, 2004, 304(5676): 1497-1500.
01 背景
根据世界卫生组织国际癌症研究机构 (IARC) 发布的 2021 年全球最新癌症负担数据：全球新发癌症病例 1970 万，全球癌症死亡病例 950 万；中国新发癌症病例 499 万，中国癌症死亡病例 327 万，分占全球的 25.33% 和 34.42%[1]。癌症已经成为全球第二大死亡原因，造成了六分之一的死亡，其已成为 21 世纪全球最具有挑战性的公共卫生问题之一。不过，目前的科学证据表明，几乎所有癌症，如果能在早期被发现、诊断和治疗，生存率机会将大大增加。
随着人类对疾病认识的不断加深，肿瘤的治疗模式也在发生变革，在“精准医疗”的大环境下，个体化精准治疗模式逐渐成为主流。随着基因检测技术的快速进步以及多学科交叉应用的发展和一系列药物临床研究的突破，近年来新发现的肿瘤驱动基因不断增多，推动了癌症靶向治疗药物的研发和临床应用[2]。
02 热点突变检测
热点 (HotSpot) 突变通常指基因序列中突变几率较高的碱基。热点突变可能会导致蛋白质功能改变或失调，从而影响生物体的正常生长和发育，进而导致癌症等疾病的发生。与正选择相关的热点突变常在癌症驱动基因中累积，如 BRAF 中的 V600E 突变，EGFR 中的 L858R 突变，常被称为“驱动热点突变”；一些特定的热点突变经常出现在特定的肿瘤中，但与癌症的发生和进展无关，被称之为“乘客热点突变”[3-6]。
在癌症研究和诊疗中，热点突变检测的意义在于能够在临床上对不同亚型的肿瘤进行准确的分类和诊断，从而为患者提供更好的个体化治疗方案；此外，某些热点突变与肿瘤的生长、转移和治疗反应有关，例如：BRAF V600E 突变与恶性黑色素瘤的不良预后[7]、EGFR L858R 突变与非小细胞肺癌的靶向治疗反应[8]等。热点突变检测可以帮助预测患者的治疗效果和预后，并及时调整治疗方案。同时，通过对热点突变的检测和分析，可以更深入地了解肿瘤发生的分子机制，有助于研究人员开发新的靶向治疗方法和药物，提升肿瘤治疗的效果，提高患者的生存率和生活质量。
因此，纳昂达推出 μCaler® HotSpot Panel v1.0 搭载 μCaler® 杂交捕获富集系统，能够在提高实验效率的同时保证小靶区捕获的稳定性，为一些常见癌症的临床研究及应用手段提供支持。
03 产品简介
μCaler® HotSpot Panel v1.0 靶向肿瘤突变“热点”区域，精选了包括结直肠癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、甲状腺癌、黑色素瘤等在内的与致癌和肿瘤抑制相关的 49 个热点突变基因，涵盖了 COSMIC 数据库中 2585 个已知癌症突变，探针覆盖基因组约 25 Kb 区域。
该 Panel 搭配 μCaler® Hybrid Capture Reagents 及 μCaler® NanoBlcokers 使用。基于全新的 μCaler® 杂交捕获富集系统，μCaler® HotSpot Panel v1.0 提升了捕获效率，捕获表现稳定优异且显著减少操作步骤，大幅度缩短实验时间和降低实验操作难度，实现更高效的测序并节省成本。
04 产品表现
4.1 优异的捕获性能
μCaler® HotSpot Panel v1.0 搭配 μCaler® 杂交捕获富集系统使用，其以极为快速和简便的实验流程，为小靶区的富集提供了优异的捕获性能。μCaler® HotSpot Panel v1.0 覆盖基因组约 25 Kb 区域，中靶率可达到 70% 以上；0.2x 平均覆盖深度均高于 99.3%，0.5x 平均覆盖深度均高于 88.4%。
图 1. μCaler® HotSpot Panel v1.0 的捕获表现。100 ng 人类男性基因 DNA 标准品 (Promega，G1471) 和 OncoOne 泛肿瘤 gDNA 标准品 (LDT Bioscience， LDT900)，利用 NadPrep® 快速 DNA 酶切文库构建试剂盒 v2 进行预文库构建。500 ng/预文库投入，参照 μCaler® 杂交捕获指南。利用 BWA 比对到参考基因组 hg38，On-target 按照 reads 数计算。A. 捕获数据的中靶率、比对率；B. 靶区域覆盖度；C. 靶区域覆盖均一性。
注：测序模式为 Illumina Novaseq 6000，PE150。
4.2 标准品变异一致性分析
单核苷酸多态性 (SNP) 和插入缺失 (InDel) 是基因组变异的常见来源，也是引起人类疾病的重要原因。我们选用了OncoOne 泛肿瘤 gDNA 标准品 (LDT Bioscience，LDT900) 用以评估分析 μCaler® HotSpot Panel v1.0 的变异频率检出的一致性。LDT900 包含了肺癌、肝癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌等癌种在内的多种热点突变类型，涵盖 SNP、InDel、CNV、Fusion，且经过 ddPCR 与 WES 双验证。结果显示，μCaler® HotSpot Panel v1.0 捕获数据中变异频率与标准品提供的参考值基本一致。
图 2. μCaler® HotSpot Panel v1.0 捕获数据中变异频率与标准品频率的一致性。利用 NadPrep® 快速 DNA 酶切文库构建试剂盒 v2 构建预文库，以μCaler® HotSpot Panel v1.0完成杂交捕获，Vardict 1.5.1 进行变异分析。测序模式：Illumina Novaseq 6000，PE150。
注：样本为人类男性基因组 DNA 标准品 (Promega，G1471) 和 OncoOne 泛肿瘤 gDNA 标准品 (LDT Bioscience，LDT900)。
4.3 靶标基因拷贝数分析
μCaler® HotSpot Panel v1.0 针对热点区域设计，但是对于基因的拷贝数变化，仍然能够如实反映。图3. 中选取了靶区个数大于 2 的基因，以平均相对覆盖深度计算基因拷贝数；其中 MET 为 4 拷贝，与参考值一致。
图 3. μCaler® HotSpot Panel v1.0 对标准品样本的拷贝数变异分析。利用 NadPrep® 快速 DNA 酶切文库构建试剂盒 v2 构建预文库，以 μCaler® HotSpot Panel v1.0 完成杂交捕获。测序模式：Illumina Novaseq 6000，PE150。
注：样本为OncoOne 泛肿瘤 gDNA 标准品 (LDT Bioscience，LDT900)。
05 订购信息
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产品名称 |
货号 |
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μCaler® HotSpot Panel v1.0, 96 rxn |
1101401 |
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μCaler® HotSpot Panel v1.0, 16 rxn |
1101402 |
参考文献
[1] https://www.who.int/zh/news-room/fact-sheets/detail/cancer
[2] 二代测序技术在NSCLC中的临床应用中国专家共识(2020版).
[3] Bergstrom E N, Luebeck J, Petljak M, et al. Mapping clustered mutations in cancer reveals APOBEC3 mutagenesis of ecDNA[J]. Nature, 2022, 602(7897): 510-517.
[4] Trevino V. Modeling and analysis of site-specific mutations in cancer identifies known plus putative novel hotspots and bias due to contextual sequences[J]. Computational and Structural Biotechnology Journal, 2020, 18: 1664-1675.
[5] Loo E, Khalili P, Beuhler K, et al. BRAF V600E mutation across multiple tumor types: correlation between DNA-based sequencing and mutation-specific immunohistochemistry[J]. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology, 2018, 26(10): 709-713.
[6] Hess J M, Bernards A, Kim J, et al. Passenger hotspot mutations in cancer[J]. Cancer Cell, 2019, 36(3): 288-301. e14.
[7] Long G V, Menzies A M, Nagrial A M, et al. Prognostic and clinicopathologic associations of oncogenic BRAF in metastatic melanoma[J]. Journal of Clinical Oncology, 2011, 29(10): 1239-1246.
[8] Paez J G, Janne P A, Lee J C, et al. EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy[J]. Science, 2004, 304(5676): 1497-1500.
