新品上线 | 双平台 (MGI & Illumina) 通用接头来了！

NGS 由于其高效、低成本的优势得到了空前发展，推动了分子生物学、基因组学、肿瘤学等其他疾病相关学科的研究进展，主流测序平台包括 Illumina、华大智造 (MGI)、ThermoFisher 等。在 Illumina 测序平台，单个 DNA 分子通过桥式 PCR 扩增的方式成簇，从而增强荧光信号强度；而 MGI 测序平台通过滚环扩增提高单个 DNA 分子的拷贝数，增强信号的同时避免了 PCR 错误累积的发生。因此，在测序质量相近的情况下，MGI 测序平台的文库重复率更低，数据利用率更高^[1] (图1)。据报道，MGI 测序平台的接头串扰率（Index hopping rate）也显著低于 Illumina 平台，仅为 0.0001-0.0004%^[2]。

图1. 不同测序平台的重复率表现。50ng gDNA (Promega-Female, G1521) ) 利用 NadPrep^® DNA Library Prepration Kit (for Illumina^®) 搭配 NadPrep^® Universal Stubby Adapter (UDI) Module 进行文库构建，扩增5个循环，测序模式分别为 MGISEQ-2000, PE100 和 Illumina NovaSeq 6000, PE150 ，downsampling 至 4 M reads pair 分析。

为充分利用 MGI 平台低重复率和低成本的测序优势，华大智造官方推出 MGIEasy 通用文库转换试剂盒 (App-A)，可实现对 Illumina 平台文库的兼容。具体原理是将 Illumina 平台文库经 PCR 扩增后，再转换成单链环状文库，然后在 MGI 平台测序。但这种方式并不完美，额外的 PCR 扩增使得 MGI 平台低重复率优势被削弱。此外，Illumina 平台文库多为双端 8 nt Index，转换测序流程也存在一定的不兼容。

NadPrep^® Universal Stubby Adapter (UDI) Module 系列接头模块包含通用截短型接头 (Universal Stubby Adapter)、通用双端唯一 10 nt 标签扩增引物 (Universal UDI-index Primer Mix) 以及用于杂交后文库扩增的引物 (Amplification Primer Mix II)。该产品构建的文库仍为 Illumina TruSeq 类型，带有 5' 端磷酸化修饰，可直接在 Illumina 平台测序，也可直接环化后在 MGI 平台测序（图2）。

图 2. 纳昂达双平台通用接头与 MGI App-A 转换流程比较。

NadPrep^® Universal Stubby Adapter (UDI) Module 沿用纳昂达 MDI 接头设计理念，为 10 nt 4 Index 平衡： ≥ 4 个连续 Index 文库等比例混合测序时，Index 中各碱基即可满足 MGI 平台推荐的 ≥ 12.5% 比例，从而有效提高数据的拆分使用。而 Illumina 平台的多数 Index 设计方案，例如 Vendor I*  的 UDI Adapter，即使多达 12 个连续 Index，仍无法满足测序要求。

图 3. NadPrep^® Universal Stubby Adapter (UDI) 碱基平衡设计。

使用 NadPrep^® Universal Stubby Adapter (UDI) Module 构建的文库带有 5' 端磷酸化修饰，无需进行额外 PCR 扩增的 App-A 转换，可直接环化后在 MGI 平台测序，有效发挥 MGI 平台测序的低数据冗余优势。在典型的杂交捕获实验中，当使用同一样本构建的通用文库分别在 MGI 和 Illumina 平台测序，中靶率和覆盖均一性几乎一致，唯一区别在于 MGI 平台测序的重复率更低，平均重复率（Duplication rate）分别为 ~26% 和 ~2% （随机选取 5 M Reads Pair 分析）。这意味着 MGI 平台的数据利用率大约是 Illumina 平台的 1.324 倍。

图 4.  NadPrep^® Universal Stubby Adapter (UDI) Module 有效降低数据重复率。真实 FFPE 样本（10例）利用NadPrep^® DNA Library Prepration Kit (for Illumina^®) 搭配NadPrep^® Universal Stubby Adapter (UDI) Module 进行文库构建，以NanOnco Plus Panel v2.0 完成杂交捕获，在 Illumina 平台直接测序或在 MGI 平台直接环化后进行测序，按照 reads 数计算；测序平台：Illumina Novaseq 6000，PE150；MGISEQ-2000, PE150。

使用 NadPrep^® Universal Stubby Adapter (UDI) Module（10 nt） 构建的文库可以兼容 NadPrep^®️ Hybrid Capture Reagents 及 NadPrep^®️ NanoBlockers (for Illumina^®️)。杂交捕获数据表现与 NadPrep^®️ UDI Adapter (for Illumina^®) (8 nt) 文库相当。

图 5.  NadPrep^® Universal Stubby Adapter (UDI) Module 兼容杂交捕获试剂。人类男性基因组 DNA (Promega-Male, G1471) 利用 NadPrep^® DNA Library Prepration Kit (for Illumina^®) 分别搭配 NadPrep^® UDI Adapter Module (for Illumina^®) 和 NadPrep^® Universal Stubby Adapter (UDI) Module，以 LungCancer Panel v1.0 完成杂交捕获。测序平台：Illumina Novaseq 6000，PE150。

Illumina 平台文库与 MGI 平台文库的环化使用的 Splint Oligo 并不相同。纳昂达科技同步推出了三合一环化试剂盒： NadPrep^® Universal Circularization Kit v2，可以同时兼容 MGI 平台单标签 (Single Index，SI) 文库、MGI 平台双标签文库 (Dual Index，DI) 和 Illumina 平台通用接头文库的环化，更易于用户操作。另外，v2 版本环化试剂盒在 v1 基础上提升了环化效率，也进一步缩短了环化时间，敬请关注随后的新品介绍。

参考文献：

[1] Foox J, Tighe S W, Nicolet C M, et al. Performance assessment of DNA sequencing platforms in the ABRF Next-Generation Sequencing Study[J]. Nature Biotechnology, 2021, 39(9): 1129-1140.

[2] Li Q, Zhao X, Zhang W, et al. Reliable multiplex sequencing with rare index mis-assignment on DNB-based NGS platform[J]. BMC genomics, 2019, 20(1): 1-13.