NadPrep®️ 血浆游离DNA双端分子标签文库构建试剂盒（for Illumina®️）
该试剂盒搭配双端分子标签（Unique Molecular Identifier, UMI）接头，可满足血浆游离 DNA 超低频突变分析的需求。
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产品特色
- 适用于血浆游离 DNA
- 样本起始量低，文库转化率高
- 双端分子标签接头助力低频突变分析
- 包含 DNA 纯化磁珠，并适配优化的片段筛选方案
建库流程
产品表现
来源于 2 个健康捐献者的血浆游离 DNA 以 1% 比例混合，用于模拟游离血浆 DNA 中低频突变位点的检测，文库制备总投入量为 10 ng；针对已知 SNP 位点设计捕获 panel（图 1）。通过 Illumina HiSeq X, PE150 平台测序后，利用双端分子标签（UMI），在不同分析与过滤方法下进行低频突变分析（表 1）。
图 1. 低频突变模拟模型。来源于2个健康捐献者的 cfDNA 以 1% 比例混合，文库制备总投入量为 10 ng。1% 及 0.5% 模拟突变位点数量统计如右表所示。
表 1. 分析与过滤方法
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分析模式 |
详情 |
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No UMI |
根据片段在基因组上比对的起始、终止位点去除重复。 |
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SSCS |
利用单链分子标签进行一致性分析（Call Molecular Consensus Reads），形成单链一致性序列（Single Strand Consensus Sequences, SSCS）。 |
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DCS211 |
利用双链分子标签，即互补链（Top / Bottom）分子标签进行一致性分析，形成双链一致性序列（Duplex Consensus Sequences, DCS），且Top与Bottom Reads均 ≥ 1。 |
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DCS633 |
利用双链分子标签，即互补链（Top / Bottom）分子标签进行一致性分析，形成 DCS，且 Top 与 Bottom Reads 均 ≥ 3。 |
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DCS211 (≥ 2) |
在 DCS211 的基础上，支持该突变的 DCS 一致性序列 ≥ 2。 |
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DCS633 (≥ 2) |
在 DCS633 的基础上，支持该突变的 DCS 一致性序列 ≥ 2。 |
突变频率符合预期
图 2. 1% 与 0.5% 模拟突变位点的频率估算。
不同分析模式过滤背景“噪音”
图 3. 不同分析模式对背景噪音的过滤。
灵敏度与阳性预测值
图 4. 1% 和 0.5% 模拟突变位点在不同分析模式下的灵敏度（A）与阳性预测值（B）。
本产品仅限研究使用，不用于临床诊断。
通用建库模块
| 包装编号 | 管盖颜色 | 组分名称 |
包装体积 1002101 (24 rxn) |
包装体积 1002103 (96 rxn) |
| Box1 |
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EndRepair & A-Tailing Buffer | 180 µL | 690 µL |
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End Repair & A-Tailing Enzyme | 120 µL | 460 µL | |
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Ligation Buffer | 750 µL | 2×1500 µL | |
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DNA Ligase | 60 µL | 230 µL | |
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2X HiFi PCR Master Mix | 720 µL | 2×1600 µL | |
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NadPrep Amplification Primer Mix II | 145 µL | 650 µL | |
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/ |
Nuclease Free Water | 2.5 mL | 8 mL | |
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TE Solution | 1 mL | 4 mL | |
| Box2 |
/ |
NadPrep SP Beads | 4 mL | 15 mL |
分子标签接头模块
管盖颜色
组分名称
包装体积
1103111 (24 rxn)
包装体积
1103121 (96 rxn)
包装体积
1103122 (96 rxn)
NadPrep Universal UDI-Index
Primer Mix #
12×15 µL
24×25 µL
24×25 µL
NadPrep UMI Adapter
60 µL
230 µL
230 µL
NadPrep Amplification Primer Mix II
20 μL
75 μL
75 μL
NadPrep® 血浆游离 DNA 双端分子标签文库构建试剂盒对 cfDNA 样本的定量及片段质检，建议如下：
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类别 |
要求 |
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提取试剂盒推荐 |
cfDNA |
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit（Qiagen；货号：55114） |
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溶剂 |
推荐使用无核酸酶水、0.1 × TE（low TE）、10 mM Tris-HCl（pH 8.0~8.5）或提取试剂盒配备的Buffer溶解DNA样品。酶切片段化试剂多对EDTA浓度敏感，应避免使用含EDTA的溶剂溶解。如有必要可进行1.8-2.0 ×磁珠纯化去除。 |
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定量 |
基于分光光度计原理的NanoDrop和基于双链DNA荧光染料的Qubit®、PicoGreen®进行定量。 |
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纯度 |
OD260/OD280=1.8-2.0；OD260/OD230=2.0-2.5。OD260/OD280>1.9表明有 RNA 污染，<1.6表明有蛋白质、酚等污染；OD260/OD230<2.0，则表明有碳水化合物、盐类或者有机溶剂污染。 |
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片段分布 |
cfDNA |
Bioanalyzer或Bioptic（Qsep）分析主峰~160 bp，次峰~320 bp。 |
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纳昂达针对Illumina®平台目前有以下接头类型可供选择，用以与NadPrep®DNA建库模块搭配，形成完整的 DNA 文库构建体系。
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接头类型 |
货号 |
说明 |
推荐应用 |
|---|---|---|---|
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NadPrep®UDI Adapter |
24 rxn，Index 1-12，1003221 24 rxn，Index 13-24，1003222 480 rxn，Index 289-384，1003227 |
双端唯一8 nt index全长接头；1-384种 |
全基因组、宏基因组、液相杂交靶向捕获测序 |
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NadPrep®UMI Adapter |
96 rxn，1003431 96 rxn，1003432 480 rxn，1003439 |
含随机分子标签通用短接头，可搭配双端唯一8 nt index引物，构建全长文库；1-384种 |
低频突变检测（~1%或以下突变频率） |
接头比例过高会导致接头或接头二聚体残留；接头比例若不足则会影响连接效率进而降低文库产量。接头使用还应注意保存方式、稀释方法和稀释浓度：
• 保存：避免反复冻融，如欲多次使用，应提前分装；
• 稀释液：推荐使用试剂盒内TE Solution进行接头的稀释，但稀释液不建议长期保存；
• 稀释用量：根据样本起始投入量、片段大小，计算合适的接头与DNA片段摩尔比，可达最佳产量。具体推荐摩尔比，可参考相关说明书。
• 注意事项：保持连接反应在冰上进行，接头与连接体系分别加入，避免提前自连。
文库长度分布可通过凝胶电泳、Bioanalyzer或者 Bioptic（Qsep）等生物分析系统进行检测，但应注意不同分析仪器的文库片段读数可能会存在一定的偏差。常见的异常文库片段分布原因如下：
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异常峰型 |
产生原因 |
解决办法 |
|---|---|---|
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有多个短片段（~50 bp）小峰 |
接头冗余 |
合适的Input DNA量和接头使用量；注意加样及连接条件 |
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有双峰（额外单个短片段峰） |
过度扩增 |
降低Input DNA量，降低扩增循环数 |
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额外有长片段峰 |
磁珠残留 |
纯化步骤时小心操作，以去除全部磁珠 |
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产品 |
详情 |
货号 |
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NadPrep®️ DNA Library Preparation Kit (for Illumina®️) G24 |
24 rxn |
1002101 |
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NadPrep®️ DNA Library Preparation Kit (for Illumina®️) E96 |
96 rxn |
1002103 |
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NadPrep®️ UMI Adapter Kit Set A1 (with 10 nt Index), 24 rxn |
1-12 |
1103111 |
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NadPrep®️ UMI Adapter Kit Set B1 (with 10 nt Index), 96 rxn |
1-24 |
1103121 |
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NadPrep®️ UMI Adapter Kit Set B2 (with 10 nt Index), 96 rxn |
25-48 |
1103122 |
本产品仅限研究使用，不用于临床诊断。
我们的工作人员将在1个工作日内与您取得联系。
如果有任何问题，欢迎联系
400 8717 699 或 support@njnad.com。