新品上线 | μCaler® EMS Panel v1.0：精准检测多基因甲基化，筛查 9 大高发癌种

01 背景

癌症早期筛查能有效提高早期癌症患者 (表面健康人群) 的占比，使患者能够更早接受干预和治疗，从而降低死亡率，提高癌症患者的五年生存率。但是相较已被广泛接受的健康体检，国内癌症早筛早检的接受度和普及率仍较低。以结直肠癌为例，Ⅰ期 (早期) 患者 5 年生存率可以达到 90% 以上，Ⅳ期 (晚期) 患者则降至 14%^[1]。目前，中国结直肠癌Ⅰ期患者占比仅 15.2%，远低于美国的 24.1%。传统的肿瘤标志物可能在检出率的灵敏度和准确性稍有逊色，也往往局限于单一癌种，这些都是影响癌症早筛推广的限制因素。与蛋白质、片段组学、小分子代谢物、miRNA、以及 ctDNA 突变等癌症早筛潜在标志物相比，DNA 甲基化几乎出现在所有癌症的癌前病变及癌症早期阶段。DNA 甲基化标志物不仅在修饰位点上具有多样性，而且具有组织/癌种特异性，同时在信号丰度和信号强度方面具有明显的优势，因此被认为是目前应用前景最广泛的多癌种早筛标志物之一。

在 2023 年 11 月，纳昂达推出了全球首创的 μCaler^® 甲基化杂交捕获富集系统 (新品上线 | μCaler^® 甲基化检测助力实现多癌种早筛新突破 (上)；新品上线 | μCaler^® 甲基化检测助力实现多癌种早筛新突破 (下))。该系统采用独有的 μCaler^® 专利杂交捕获技术，为用户提供了精准、稳定、高效、快速且简单的甲基化测序新体验；不仅提升了甲基化检测的效率和准确性，更为多癌种早期筛查提供了新的突破。

为了充分发挥 μCaler^® 甲基化杂交捕获富集系统在肿瘤早筛领域的优势，纳昂达即将推出 μCaler^® EMS Panel v1.0 (Early Methylation for Screening，以下简称为 “EMS”)。EMS 与最新升级的 μCaler^® Hybrid Capture Reagents v2 和 μCaler^® NanoBlockers 相结合，形成了全面优化的甲基化早筛技术解决方案。该方案能够精准捕获并转化甲基化文库，全面覆盖待测样本中目标癌种候选基因的甲基化状态靶标，为癌症的早期筛查和检测提供了有力支持。

 

02 方案介绍

2.1 EMS 简介

μCaler^® EMS Panel v1.0 覆盖 9 大高发癌种，包括肺癌、结直肠癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌、宫颈癌、卵巢癌，涉及 76 个与致癌和肿瘤抑制相关的甲基化候选基因。既包含 NMPA (国家药品监督管理局) 和 FDA (美国食品药品监督管理局) 已批准的 CpG 位点，也同时囊括了文献和专利报道中具有重要意义的 CpG 位点，共计 2,097 个。探针设计涵盖基因组约 20 Kb 区域，为全面且精准的甲基化早筛提供支持。

表 1. μCaler^® EMS Panel v1.0覆盖癌种及基因列表

 

2.2 方案特点

多癌种检测：一次性覆盖 9 大癌种多基因的 CpG 位点。

多样本兼容：适用于 gDNA、cfDNA 和不同等级的 FFPE 样本。

精准定量甲基化水平：实现对待检测样本的甲基化水平的准确定量。

高效捕获技术：结合 μCaler^® 甲基化杂交捕获富集系统，确保数据质量均一，捕获效率和稳定性更高。

可靠性高：采用独家专利型探针设计，全面检测甲基化状态，提供可靠的结果。

稳定的交付周期：自有核酸工厂，现货交付，保障交货周期的稳定性。

灵活定制：针对特定单一/多癌种，支持定制包含不同基因及不同规模 CpG 位点的 Panel 单独使用或者 Spike-in。

 

图 1. μCaler^® 显著提升甲基化水平定量的精确性。

注：*不同甲基化水平的模拟样本评估标准分别为：0 ± 5%，2 ± 5%，10 ± 5%，50 ± 15%，100 ± 15%。准确率为符合评估标准的位点数占比。

 

03 产品表现

3.1 兼容不同样本类型

3.1.1 gDNA & cfDNA

利用人类基因组 DNA 标准品和血浆 cfDNA 样本进行甲基化文库构建，以 μCaler^® EMS Panel v1.0 完成杂交捕获。其中，gDNA 样本的捕获表现如图 2. A & C 所示，平均中靶率达到 60% 以上；0.2x CpG 平均覆盖深度均高达 99% 以上，且 0.5x CpG 平均覆盖深度也保持在 95% 以上，对所有待检 CpG 位点的覆盖度表现出色，Fold 80 值也控制在 1.5 以下。血浆 cfDNA 样本的捕获表现如图 2. B & C 所示，无论是亚硫酸氢盐转化法 (BS) 还是酶转化法 (EM)，平均中靶率均能达到 55% 以上；0.2x CpG 平均覆盖深度均高于 99%，且 0.5x CpG 平均覆盖深度也维持在 95% 以上，Fold 80 值也控制在 1.8 以下。

 

 

 

 

图 2. μCaler^® EMS Panel v1.0 应用于 gDNA 及 cfDNA 样本时的捕获表现。A. gDNA 样本；B. cfDNA 样本；C. Fold 80 base penalty；D. gDNA 样本靶区域 CpG total depth (去重后)。使用 NadPrep^® Methyl Library Preparation Module 分别对样本进行预文库构建，gDNA 使用 NadPrep^® DNA Methyl Bisulfite Conversion Module (BS) 进行甲基化文库转化，cfDNA 分别使用 BS 和 EM 两种方式进行甲基化文库转化，500 ng/预文库投入，以 μCaler^® Hybrid Capture Reagents v2 和 μCaler^® EMS Panel v1.0 完成杂交捕获。

注：gDNA 样本为人类基因组 DNA 标准品 (Promega, G1471)，投入量 50 ng；cfDNA 样本为血浆 cfDNA，投入量 20 ng。

 

3.1.2 FFPE 样本

FFPE 样本因其能够长时间保存组织或制备检验所需组织标本而在临床病理检验和肿瘤基因检测中得到广泛应用。然而，由于 FFPE 样本通常具有较差的核酸质量，其影响了文库构建的质量，这一问题饱受诟病。通过对不同等级的 FFPE 样本进行 DNA 甲基化文库构建，以 μCaler^® EMS Panel v1.0 完成杂交捕获。如图 3. 所示，EMS 可有效检测不同等级的 FFPE DNA 样本，其 0.2x CpG 平均覆盖深度均超过 98%。即使对于 FFPE D 级样本，0.5x CpG 平均覆盖深度也能达到 80% 以上。

 

 

图 3. μCaler^® EMS Panel v1.0 应用于不同等级 FFPE 样本时的捕获表现。A. 捕获表现；B. Fold 80 base penalty。使用 NadPrep^® Methyl Library Preparation Module 分别对样本进行预文库构建，衔接 NadPrep^® DNA Methyl Bisulfite Conversion Module 进行甲基化文库转化，500 ng/ 预文库投入，以 μCaler^® Hybrid Capture Reagents v2 和 μCaler^® EMS Panel v1.0 完成杂交捕获。

注：FFPE 为临床肺癌样本，投入量 50 ng。样本分级标准：FFPE B：15 Kb 左右有主带，但存在中度弥散；FFPE C：条带主要分布在 200-2500 bp，呈弥散状；FFPE D：条带主要分布在 100-1000 bp，呈弥散状。

 

3.2 临床样本检测表现

3.2.1 结直肠癌

使用结直肠癌的临床配对样本对 μCaler^® EMS Panel v1.0 的检测性能进行了测试。结果表明，肿瘤组织和癌旁组织的 0.2x CpG 平均覆盖深度均高于 99% (图 4. B)。在 4 组配对样本之间，甲基化水平存在显著差异：肿瘤组织的甲基化水平明显高于癌旁组织 (图 5. A & B)。7 个结直肠癌候选 Biomarker 均已获得 NMPA 或 FDA 的批准，其在肿瘤组织中的甲基化水平都普遍高于癌旁组织。然而，也有一些位点在癌旁组织中呈现高甲基化状态 (图 5. B)，这可能与癌旁组织的取材具有一定的相关性。此外，结直肠癌候选 Biomarker 在不同个体间的甲基化状态具有一定的差异，说明多位点甲基化检测对结直肠癌早筛具有重要意义。

 

 

 

图 4. μCaler^® EMS Panel v1.0 应用于临床结直肠癌及其癌旁组织时的捕获表现。A. 中靶率 & 比对率；B. CpG 覆盖度；C. Fold 80 base penalty。

注：CRC: Colorectal Cancer。

 

 

 

图 5. μCaler^® EMS Panel v1.0 应用于临床结直肠癌及其癌旁组织时的甲基化水平检出情况。A. 结直肠癌配对样本 CpG 甲基化水平；B. 结直肠癌候选 Biomarker 在临床样本中的 CpG 甲基化水平。

注：CRC: Colorectal Cancer；Pt: Peritumoral tissue。

 

3.2.2 卵巢癌

此外，我们还利用卵巢癌的临床配对样本对 μCaler^® EMS Panel v1.0 的检测性能进行了验证。结果显示，0.2x CpG 平均覆盖深度均高于 99%，且 0.5x CpG 平均覆盖深度均高于 95%，表现出良好的覆盖度 (图 6. B)。在 3 组配对样本之间，肿瘤组织的甲基化水平明显高于相应的癌旁样本和对照样本 (Promega, G1471) (图 7. A)，这表明 EMS 能够有效地检测肿瘤与癌旁组织之间的甲基化水平差异。

卵巢癌候选 Biomarker 包括 NMPA 正在审批中的位点和 FDA 已获批的位点。大多数 Biomarker 在肿瘤组织中呈现高甲基化状态，在癌旁组织中则呈现低甲基化状态 (图 7. B)。然而，也存在部分 Biomarker，虽然在肿瘤组织中的甲基化水平高于癌旁组织，但在癌旁组织和对照样本中的甲基化水平仍然相对较高，例如 FOXD3、LYPD5、PCDHB18P (图 7. B)。此外，我们还发现这 3 个基因在其他癌种中也存在类似的情况。因此，Biomarker 是否适用于卵巢癌早筛，还需要结合更多的临床数据进一步验证和筛选。

 

 

图 6. μCaler^® EMS Panel v1.0 应用于临床卵巢癌及其癌旁组织时的捕获表现。 A.中靶率 & 比对率；B. CpG 覆盖度；C. Fold 80 base penalty。

注：OVCA: Ovarian Cancer。

 

 

 

图 7. μCaler^® EMS Panel v1.0 应用于临床卵巢癌及其癌旁组织时的甲基化水平检出情况。A. 卵巢癌配对样本 CpG 甲基化水平； B.卵巢癌候选 Biomarker 在临床样本中的 CpG 甲基化水平。

注：OVCA: Ovarian Cancer；Pt: Peritumoral tissue。

 

04 应用展望

甲基化作为一种重要的表观遗传标志物，目前在肿瘤相关的多个方面展现了巨大的应用前景，包括：肿瘤早筛/早诊、分子分型、预后分层、疗效评估等，因此，建立和筛选 Biomarker 成为当前的主要研究方向。μCaler^® EMS Panel v1.0 采用了专利型探针设计，并搭载全新的 μCaler^® 甲基化杂交捕获富集系统，应用于多癌种甲基化检测领域。在该 Panel 已覆盖的基因和位点的基础上，用户可以选择自主补充所需的 CpG 位点，增加了其灵活性和适用性。

纳昂达专注于为临床队列研究、Biomarker 开发和验证提供全流程解决方案和技术支持。全面的技术解决方案将有助于加速早筛产品的研究进程，为肿瘤早期诊断领域做出积极的贡献。