新品上线 | 文库构建试剂盒升级，轻松实现更高产出及转化率！

01 背景

DNA 文库构建是高通量测序 (Next Generation Sequencing, NGS) 技术的基础，其过程是将待测样本的大片段基因组 DNA 通过超声或酶切打断为小片段 DNA，然后在小片段 DNA 分子两端连接特定的测序接头，形成符合测序平台要求的有效文库。

常规的 NGS 实验全流程包括核酸提取、文库构建、靶向捕获、上机测序及数据分析等环节。其中，文库构建作为 NGS 湿实验流程中的核心环节，对于成功进行 NGS 工作流程至关重要。因此，选用不同的文库构建试剂盒制备的文库质量直接影响着最终测序结果的准确性和可靠性。随着 NGS 技术的不断进步，NGS 已广泛应用于基础研究、遗传病检测、NIPT、肿瘤伴随诊断、胚胎植入前筛查以及感染病原体鉴定等领域，应用端对测序文库的稳定性、有效性、准确性和高效性等提出了更高要求。由此看来，NGS 文库构建流程的便捷性以及转化率 (起始 DNA 成功转化为可测序文库的比例) 的提升显得尤为重要。

因此，为满足市场需求，纳昂达推出了升级版文库制备试剂盒：NadPrep^® DNA Library Preparation Module v2，可在3 hr 内完成全基因组文库制备。在 v1 版本的基础上，v2 版本提高了低质量样本的文库产量与质量，且提升了文库转化率。此外，NadPrep^® DNA Library Preparation Module v2 兼容纳昂达已推出的不同平台和不同类型接头，支持自由选择搭配。

 

02 升级版文库制备试剂盒

2.1 产品简介

NadPrep^® DNA Library Preparation Module v2 是针对 MGI & Illumina 高通量测序平台开发的双链 DNA 文库构建试剂盒。该试剂盒基于 A-T 连接原理，操作流程简单，适用于 1‒500 ng 起始 DNA 量的全基因组测序，同时兼容液相杂交靶向捕获测序。在 v1 版本的基础上，升级后的试剂盒提高了文库转化率，同时对低质量的样本包容度更好，因此能在维持高保真度的同时，提升文库的丰富度。

 

图 1. NadPrep^® DNA Library Preparation Module v2 实验流程

 

2.2 产品特色

 

图 2. NadPrep^® DNA Library Preparation Module v2 产品特色

 

03 产品表现

3.1 文库产出稳定高效

3.1.1 兼容宽泛的投入量

以不同起始投入量的人类基因组 DNA 标准品 (Promega, G1521) 为模板，使用 NadPrep^® DNA Library Preparation Module v2 进行文库构建。结果显示，各起始投入量下文库产出均可达到目标产量，表明该试剂盒适用于 1 ng-500 ng 的样本起始投入量。

 

 

图 3. NadPrep^® DNA 文库构建试剂盒 v2 对不同起始量 gDNA 样本的建库产出。利用 NadPrep^® DNA Library Preparation Module v2 分别搭配 NadPrep^® Universal Adapter (MDI) Module (for MGI) 和 NadPrep^® Universal Stubby Adapter (UDI) Module 进行文库构建。A. 文库产出 (MGI)；B. 文库产出 (Illumina)。

 

3.1.2 兼容不同类型样本

对于不同类型样本，如 cfDNA、gDNA、FFPE DNA 等，NadPrep^® DNA Library Preparation Module v2 均可实现稳定高效的文库产出，实现不同应用场景的高度兼容。

 

 

图 4. NadPrep^® DNA 文库构建试剂盒 v2 对不同类型样本均有稳定优异的文库产出。不同类型样本利用 NadPrep^® DNA Library Preparation Module v2 分别搭配 A. NadPrep^® Universal Stubby Adapter (UDI) Module 和 B. NadPrep^® BMI Adapter (MDI) Module (for MGI) 和 NadPrep^® UMI Adapter Kit (with 10 nt Index) 进行文库构建，扩增循环数参考相应说明书。

注：样本分级标准 | gDNA：~ 15 kb 有明亮单一不拖尾条带；FFPE C：条带主要分布在 200-2500 bp，呈弥散状。

 

3.1.3 兼容不同类型接头

使用 NadPrep^® DNA Library Preparation Module v2 分别搭配不同类型接头进行文库构建，均可实现稳定的文库产出。相较于 v1 版本，NadPrep^® DNA Library Preparation Module v2 进行了针对性优化，文库产量获得了显著提升 (图 5. )。

 

图 5. NadPrep^® DNA 文库构建试剂盒 v2 显著提升文库产出。不同投入量样本利用 NadPrep^® DNA Library Preparation Kit/Module (for Illumina^®/MGI) (NadPrep^® v1) 和 NadPrep^® DNA Library Preparation Module v2 (NadPrep^® v2) 分别搭配 NadPrep^® Universal Stubby Adapter (UDI) Adapter、NadPrep^® Universal Adapter (MDI) Module (for MGI)、NadPrep^® UMI Adapter (with 10 nt Index) 和 NadPrep^® BMI Adapter (MDI) Module (for MGI) 进行文库构建。

注：gDNA 样本为人类基因组 DNA 标准品 (Promega，G1471)。

 

3.2 低 GC 偏好性

我们比较了 NadPrep^® DNA Library Preparation Module v2 和 Vendor K* & V* 在不同 GC 含量微生物群组 DNA 标准品 (Zymo Research，D6306) 的 GC 偏好性。结果显示，NadPrep^® DNA Library Preparation Module v2 具有低 GC 偏好性。

 

图 6. NadPrep^® DNA 文库构建试剂盒 v2 对宏基因组样本的建库表现。 A.金黄色葡萄球菌， B.大肠埃希菌和 C.  铜绿假单胞菌等不同 GC 含量的全基因组文库的低 GC 偏好性。

 

3.3 更高的文库转化率

文库转化率是评估文库质量的重要指标，它直接影响着文库的丰富度和质量，从而对后续的测序分析结果产生重要影响。在 cfDNA 样本中的超低频突变的识别过程中，高转化率显得尤为重要，因为更高的转化率意味着文库拥有更高的复杂性和覆盖范围。相较于 v1 版本，NadPrep^® DNA Library Preparation Module v2 对此进行了精细的优化，使得文库转化率得到了明显提升；此外，与 Vendor  K* & V* 相比，NadPrep^® DNA Library Preparation Module v2 的文库转化率更高，进一步突显了其在文库构建效率和质量上的优势。

 

图 7. NadPrep^® DNA 文库构建试剂盒 v2 具有更高的文库转化率。 10 ng 血浆 cfDNA 样本利用 NadPrep^® DNA Library Preparation Module v2 分别搭配 NadPrep^® BMI Adapter (MDI) Module 和 NadPrep^® UMI Adapter (with 10 nt Index) 进行预文库构建，以 2 Kb Panel 搭配 μCaler 杂交捕获系统完成杂交捕获。测序模式分别为 DNBSEQ-T7，PE150 和 Illumina Novaseq 6000，PE150。每个样本随机选取 1.0 Gb 用于数据分析，以双链一致性序列 (Duplex Consensus Sequences, DCS211) 为标准进行过滤。

注：相对文库转化率为 NadPrep^® v2 及 Vendor K* & V* 文库转化率与 NadPrep^® v1 文库转化率的比值 ( NadPrep^® v1 文库转化率统一归一化为 1 )。

 

3.4 更高的文库丰富度

同样，为了评估文库的丰富度，我们使用 10 ng 血浆 cfDNA 样本构建了含有双端分子标签接头的预文库，并通过双链一致性序列覆盖的深度进行了 NadPrep^® DNA Library Preparation Module v2 和 Vendor  K* & V* 之间的性能比较。结果显示，NadPrep^® DNA Library Preparation Module v2 的文库丰富度高于 Vendor K* & V*。

 

图 8. NadPrep^® DNA 文库构建试剂盒 v2 具有更高的文库丰富度。利用 NadPrep^® DNA Library Preparation Module v2 搭配 NadPrep^® UMI Adapter (with 10 nt Index) 进行预文库构建，以 2 Kb Panel 搭配 μCaler 杂交捕获系统完成杂交捕获。测序模式为 Illumina Novaseq 6000，PE 150。每个样本随机选取 1.0 Gb 用于数据分析，以双链一致性序列 (Duplex Consensus Sequences，DCS211) 、单链一致性序列 (SSCS) 为标准进行过滤。

 

3.5 兼容液相杂交捕获

当 NadPrep^® DNA Library Preparation Module v2 应用于两款不同大小的 Panel 靶向捕获时，在捕获数据比对率、中靶率、覆盖均一性、Fold 80 等方面表现出优异的性能，延续了 v1 优秀的靶向捕获表现。

 

 

 

 

图 9. NadPrep^® DNA 文库构建试剂盒 v2 优异的捕获表现。50 ng FFPE C 级 DNA 样本利用 NadPrep^® DNA Library Preparation Module v2 构建预文库，500 ng/ 预文库投入，分别以 LungCancer Panel v1.0 (0.23 Mb) 和 NanOnco Plus Panel v3.0 (2.4 Mb) 搭配 NadPrep^® Hybrid Capture Reagents 完成杂交捕获。 A. 捕获数据的比对率和中靶率；B. 靶区域覆盖度；C. Fold 80 base penalty；D. 靶区域去重后的平均深度。

注：样本分级标准 | FFPE C：条带主要分布在 200-2500 bp，呈弥散状。

 

3.6 标准品变异分析

我们使用肿瘤结构变异 5% gDNA 标准品 (菁良，GW-OGTM001) 来评估 NadPrep^® DNA Library Preparation Module v2 构建文库的结构变异情况。结果显示，其检出的突变频率与标准品标称突变频率具有一致性。

表 1. 标准品变异频率的一致性分析

 

利用 NadPrep^® DNA Library Preparation Module v2 搭配 NadPrep^® Universal Stubby Adapter (UDI) Module 构建文库，扩增 6 个循环，以 NadPrep^® Hybrid Capture Reagents 搭配 LungCancer Panel v1.0 (0.23 Mb) 完成杂交捕获，杂交 16 hr，测序模式为 Illumina Novaseq 6000，PE150。

 

3.7 加速稳定性和冻融稳定性评价

对试剂组分经过反复冻融 15 次和 20 次后，与起始点 (0 次) 相比，文库产出轻微下降仍通过质控要求 (图 10. A & B)。将所有试剂组分经过室温 3 天、7 天及 14 天放置后，与起始点 (0 天) 相比，文库产出上均无明显差异 (图 10. C & D)。

 

 

 

 

图 10. 反复冻融和常温放置对试剂文库产出的影响。利用 NadPrep^® DNA Library Preparation Module v2 分别搭配 NadPrep^® Universal Adapter (MDI) Module (for MGI) 和 NadPrep^® Universal Stubby Adapter (UDI) Module 进行文库构建。A & C. 文库产出 (MGI)；B & D. 文库产出 (Illumina)。

注：样本来源于人类基因组 DNA 标准品 (Promega，G1471)， 10 ng 起始投入量扩增 9 个循环， 100 ng 起始投入量扩增 5 个循环。

 

04 总结

综上，NadPrep^® DNA Library Preparation Module v2 对各样本类型均有优异的建库表现，如 cfDNA、gDNA、FFPE DNA 等。通过提升文库转化率，NadPrep^® DNA Library Preparation Module v2 实现了更高的文库产出和文库丰富度；同时保持了低 GC 偏好性等优点。此外，该试剂盒可与纳昂达推出的各类型接头灵活搭配，旨在为用户提供更稳定、更有效、更准确和更高效的 NGS 文库制备方案。