冻融不能移，室温不能屈 | 靶向捕获试剂稳定性初探
01
背景
试剂类产品的稳定性对其生产、运输、保存和使用等环节具有重要的指导意义。在国家药品监督管理总局 2021 年 12 月发布的《关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告 (2021 年第 122 号)》中，明确要求提交体外诊断试剂的稳定性研究应包括：实时稳定性 (货架有效期)、使用稳定性和运输稳定性的研究报告和数据。
在靶向捕获测序的杂交反应中的探针和封阻序列，其主要有效成分为寡核苷酸，一般储存于 -20℃±5℃ 条件下，并在使用过程中保持低温和减少冻融次数，避免降解和断裂。因此，寡核苷酸类的试剂和样品的加速稳定性和冻融稳定性是使用稳定性研究的重要组成部分。
冻融稳定性：蛋白和核酸类物质易受温度变及微生物污染等影响，出现蛋白变性或降解等现象。此外，试剂在实际使用期间涉及多次冻融，因此需要进行期间稳定性研究。
加速稳定性：指在非试剂说明书中声称的储存条件下的稳定性考察。升高温度来考察加速稳定性是最常用的方式，因此也称之为热稳定性。虽然加速稳定性研究结论不能直接用于产品有效期，但是考虑到试剂在运输和使用过程中可能遇到的不确定性，产品加速稳定性研究仍具有重要意义[1]。
02
测试方案设计
本文中选取纳昂达核心版全外显子组捕获 Panel：NEXome Core Panel 和封阻序列：NadPrep® NanoBlockers (for MGI, DI) 进行稳定性测试。
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冻融稳定性测试方案
取 3 个独立批次试剂反复冻融数次，分别在反复冻融第 0、10、20、30、40、50 次后，使用标准预文库进行杂交捕获并测序，验证试剂性能。
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加速稳定性测试方案
取 3 个独立批次试剂并分成若干份，1 份于 -20℃±5℃ 正常保存，另取 6 份分别在室温下放置 1 天、3 天、8 天、12 天、19 天和 28 天，使用标准预文库进行杂交捕获并测序，验证试剂性能。
03
产品简介
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NEXome Core Panel
NEXome Core Panel 包含约 40 万条单独合成、单独质控的单链 DNA 探针，靶向 34.7Mb 基因组区域(19,613 基因)。探针设计策略中，NEXome Core Panel 在最新版本 Refseq (109，2021) 和 CCDS 数据库的基础上，精心挑选了一些数据库之外值得关注的区域，同时基于产品延续性的考虑保留了部分最新版数据库中删去的区域。作为一款核心全外显子 Panel，可与不同的子 panel 组合搭配，满足不同的应用需求。
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NadPrep® NanoBlockers (for MGI, DI)
NadPrep® NanoBlockers (for MGI) 是适用于 MGI 测序平台的通用封阻序列。该产品可与 MGI 测序平台文库的接头序列结合，降低接头间的非特异性结合，藉此提高测序读长的中靶率、增加富集深度。NadPrep® NanoBlockers (for MGI，DI) 仅适用于封闭含双端 10 nt Index 接头类型文库。
04
冻融稳定性测试结果
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NEXome Core Panel
NEXome Core Panel 经过反复冻融 0 次、10 次、20 次、30 次、40 次和 50 次后，与起始点（C0）相比，在数据比对率和中靶率基本性能指标上均无明显差异（图1. A）。同样的，不同冻融次数下的均一性指标，0.2x 平均覆盖深度、0.5x 平均覆盖深度和 Fold 80 Base Penalty 也与起始点保持一致（图1. B & C）。而三个批次多个处理间，仅在 GC 偏好上存在细微差异（图1. D）。
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图1. NEXome Core Panel 冻融稳定性测试表现。
A. 捕获数据比对率和捕获效率；B. 靶区域覆盖度；C. Fold 80 Base Penalty；D. GC 偏好性。500 ng Human Genomic DNA (Promega, G1471) 经纳昂达高通量自动化样本制备系统 NadAuto-96R 构建的预文库，利用 NadPrep® Hybrid Capture Reagents 杂交试剂盒和 NEXome Core Panel 完成杂交捕获。利用 BWA 比对到参考基因组 hg38，按照 reads 数计算。测序平台：DNBSEQ-T7，PE150。
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NadPrep® NanoBlockers (for MGI, DI)
NadPrep® NanoBlockers (for MGI, DI) 经过冻融 0 次、10 次、20 次、30 次、40 次和 50 次后，与起始点（C0）相比，在数据比对率和中靶率、覆盖均一性和 Fold 80 Base Penalty 等性能指标上无明显差异。其中冻融 10 次时的平均中靶率略低，系组内实验操作所致（图2. A & B & C）。三个批次多个处理间，GC 偏好性上也基本保持一致（图2. D）。
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图2. NadPrep® NanoBlockers (for MGI, DI) 冻融稳定性测试捕获表现。
A. 捕获数据比对率和捕获效率；B. 靶区域覆盖度；C. Fold 80 Base Penalty；D. GC偏好性。500 ng Human Genomic DNA (Promega, G1471) 经纳昂达高通量自动化样本制备系统 NadAuto-96R 构建的预文库，利用NadPrep® Hybrid Capture Reagents 杂交试剂盒和 LungCancer Panel v1.0 完成杂交捕获。利用 BWA 比对到参考基因组 hg38，按照 reads 数计算。测序平台：DNBSEQ-T7，PE150。
05
加速稳定性测试结果
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NEXome Core Panel
NEXome Core Panel 经过室温 0 天、1 天、3 天、8 天、12 天、19 天及 28 天放置后，与起始点（C0）相比，在数据比对率和中靶率基本性能指标上均无明显差异（图3. A）。均一性指标上看，0.2x 平均覆盖深度、0.5x 平均覆盖深度和 Fold 80 Base Penalty 各处理组也与起始点保持一致（图3. B & C），仅在 GC 偏好上存在细微差异（图3. D）。
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图3. NEXome Core Panel 加速稳定性测试捕获表现。
A. 捕获数据比对率和捕获效率；B. 靶区域覆盖度；C. Fold 80 Base Penalty；D. GC 偏好性。500 ng Human Genomic DNA (Promega, G1471) 经纳昂达高通量自动化样本制备系统 NadAuto-96R 构建的预文库，利用NadPrep® Hybrid Capture Reagents 杂交试剂盒和 NEXome Core Panel 完成杂交捕获。利用 BWA 比对到参考基因组 hg38，按照 reads 数计算。测序平台：DNBSEQ-T7，PE150。
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NadPrep® NanoBlockers (for MGI, DI)
NadPrep® NanoBlockers (for MGI, DI) 经过室温 0 天、1 天、3 天、8 天、12 天、19 天及 28 天处理后，与起始点（C0）相比，在数据比对率性能指标上基本无差异，但在中靶率上，各组实验内部批次存在一定波动（图4. A）。其中波动较大的第 2 组及第 5 组（室温分别处理 1 天及 12 天）的组内 3 批次重复中，至少两批次中靶率高于 89%，符合预期。均一性指标上看，0.2x 平均覆盖深度、0.5x 平均覆盖深度和 Fold 80 Base Penalty 各处理组与起始点保持一致（图4. B & C），仅在高 GC 区域有细微差异（图4. D）。
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图4. NadPrep® NanoBlockers (for MGI, DI) 加速稳定性测试捕获表现。
A. 捕获数据比对率和捕获效率；B. 靶区域覆盖度；C. Fold 80 Base Penalty；D. GC 偏好性。500 ng Human Genomic DNA (Promega, G1471) 经纳昂达高通量自动化样本制备系统 NadAuto-96R 构建的预文库，利用NadPrep® Hybrid Capture Reagents 杂交试剂盒和 LungCancer Panel v1.0 完成杂交捕获。利用 BWA 比对到参考基因组 hg38，按照 reads 数计算。测序平台：DNBSEQ-T7，PE150。
06
结论
本文检测的两款寡核苷酸类产品全外显子捕获探针 NEXome Core Panel 和封阻序列 NadPrep® NanoBlockers (for MGI, DI)，是靶向捕获测序过程中的典型试剂。经过一系列的反复冻融及加速稳定性测试的结果表明，它们总体表现均较稳定。从本文评估的参数——比对率、中靶率、GC 偏好性以及 Fold 80 Base Penalty 等参数来看，NEXome Core Panel 和 NadPrep® NanoBlockers (for MGI, DI) 在冻融达 50 次及室温放置 28 天时，性能指标依然相对稳定。我们推测原因是由于主要成分寡核苷酸片段较短、高浓度且保持在稳定溶剂中，故对环境的损伤更有弹性[2]。限于篇幅，本文未展示温度波动较大的极端和效期稳定性数据，为确保试剂性能的长期稳定，应严格按照产品说明书进行使用及保存。
07
相关产品信息
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类别 |
产品名称 |
货号 |
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文库构建模块 |
NadPrep® EZ DNA Library Preparation Module v2, 96 rxn |
1002602 |
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接头模块 |
NadPrep® Universal Adapter (MDI) Module Set D1 (for MGI), 480 rxn |
1003731 |
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杂交捕获试剂 |
NadPrep® Hybrid Capture Reagents, 96 rxn |
1005101 |
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封阻序列 |
NadPrep® NanoBlockers (for MGI, DI), 96 rxn |
1006208 |
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Panel |
NEXome Core Panel, 96 rxn |
1001851 |
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LungCancer Panel v1.0, 96 rxn |
1001921 |
关于纳昂达科技
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纳昂达科技秉承“ Nano Trans More ”的核心理念和“靶向精准，用心服务诊断”的奋斗宗旨，致力于为科研院校、医疗机构、临检单位、产业公司、测序服务商等提供专业化和高质量的靶向测序产品与闭环解决方案。
纳昂达科技已通过高新技术企业、江苏省科技型中小企业和南京市精准高通量测序工程技术研究中心认定，并拥有 > 2,000 平米的高通量测序研发中心和 > 4,000 平米的GMP级别 (YY/T 0287-2017 idt ISO 13485:2016) 体外诊断试剂生产基地，建立了从市场调研、产品设计、生产制造到售后服务完整的质量管理体系。
纳昂达专注于精准靶向试剂和配套自动化仪器的开发、生产、销售和服务，目前拥有 MGI 和 Illumina 双测序平台多款 NadPrep® 文库构建试剂盒和全套液相杂交相关产品。明星产品包括 NGS 全流程自动化工作站、肿瘤全外显子 Panel、泛实体瘤和血液肿瘤Panel以及呼吸道病毒 Panel 等，并提供全面完善的双平台捕获探针定制化服务。纳昂达科技的靶向捕获产品拥有与国际同行业媲美的高质量水准，获得了客户一致的信赖。
纳昂达的销售网络覆盖全国并已外延至海外地区。纳昂达将与客户共成长，对客户的需求全力以赴，为全球用户提供靶向测序解决方案和 IVD 试剂原料。
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电话：400 871 7699
邮箱：sales@njnad.com
网址：www.njnad.com
参考文献
[1] 徐加发, 蔡瑶. 浅析体外诊断试剂稳定性研究[J]. 中国医疗器械信息, 2017, 23(15): 30-32.
[2] Matange K, Tuck J M, Keung A J. DNA stability: a central design consideration for DNA data storage systems[J]. Nature communications, 2021, 12(1): 1-9.
