基因融合怎么做？ 新品| OncoFu Elite (for RNA) Panel 了解下！ （上篇）
RNA捕获测序（RNACap）是指靶向富集特定转录本或感兴趣的 RNA 区域的高通量测序分析方法，是 RNA-Seq 的延伸应用场景。近期市场上对于 RNACap 的需求与日俱增，其主要原因是随着精准医疗进程的深入，融合基因靶向药物种类和适应症正在不断增加。例如，针对 NTRK 融合突变的泛癌种靶药 Vitrakvi（larotrectinib）已获得 FDA 批准；由 Roche 公司开发的“不限癌种”个体化药物 Rozlytrek（entrectinib）也获得日本厚生劳动省（MHLW）批准。因此，快速、准确、全面的鉴定融合基因谱可以为患者带来更优的医疗决策。
目前，融合基因诊断主要包括荧光原位杂交(FISH)、RT-PCR 等方法。这些方法通常只鉴定单个融合基因是否存在，费用较高而且效率较低。此外，这些方法不能识别新的融合基因伴侣或解决复杂的结构重排，这也是导致假阴性结果的主要原因[1]。
多款基于 NGS 技术的 DNA 捕获测序（DNACap）的伴随诊断产品亦具有检测融合基因的能力。以 MSK-IMPACT 为例，其整体流程如下：设计覆盖融合相关基因内含子区域的探针；将探针与预文库杂交；捕获测序并分析统计嵌合型 Reads，从而发现融合事件[2]。这种方式在同一套 DNACap 流程中实现了热点基因融合的分析，但其局限性也是不容忽视的。当融合相关区域存在重复序列时（例如 ROS1 的 31 内含子），强行设置探针可能使捕获测序的中靶率降至无法接受的程度；而当融合相关区域跨度大到一定程度时（例如 NTRK3 基因的 13、14 内含子，跨度超过 180 kb），将其纳入分析范围后数据利用率的降低也是需要权衡的问题。故 DNACap 在某些融合基因位点上不具备技术可行性[3-4]。
近期 Carina 等人使用 8 种细胞系和 18 份 FFPE 组织样本对市售的五款测序型融合基因检测产品进行了对比，其结果显示基于 DNACap 的检测方法产生了不同程度的假阴性测序结果，同时该对比实验还展示了基于 RNA 的测序分析方法在非小细胞肺癌临床使用中可靠检测基因融合的应用潜力[5]。基于 RNACap 的融合基因分析相比 DNACap 有如下优势：
1、 内含子在转录本中被剪接，从而消除了 DNACap 中内含子覆盖的技术限制；
2、 其次，RNA 水平融合的检测是融合基因被转录的直接证据。对剪接序列的分析可以确定蛋白质是否会被翻译和符合读框。
3、 由于融合基因通常在组织中高度表达，融合转录本可在低肿瘤纯度样本的 RNA 中得以高可信度检测[4,6]。
因此，RNACap 可谓是为融合基因检测量身打造，具有耐受低质量或低肿瘤含量样本、高灵敏度、高确认性等优势。
已有多项临床研究表明 DNACap 和 RNACap 的联合分析可详解出包括单核苷酸变异 (SNV)、小插入或缺失 (Indel)、拷贝数变异 (CNV)、剪接变异 (SV)、基因融合 (GF)、肿瘤突变负荷 (TMB) 和微卫星不稳定性 (MSI)在内的多个分子标志物层面构建的肿瘤分子亚型，结合详细的临床注释，其综合型图谱可用于评估不同基因变异的组合对临床诊疗结果的影响[7-8]。如果 DNACap 捕获 Panel 设计得当，亦可以用于 RNACap 的分析[9]。以纳昂达明星产品 NanOnco Plus Panel v2.0 为例，FFPE RNA 融合基因标准品（菁良，GW-OPSM001）在不同梯度稀释情况下，检测结果成线性关系，直至 1：256 稀释时，方有一个位点 TPM3-NTRK1 未能检出（图1）。此实验初步表明该 panel 应用于 RNA 融合基因分析的可靠性。
▶ 图 1 | NanOnco Plus Panel v2.0 对 FFPE RNA 标准品融合基因检测。
FFPE RNA 融合基因标准品（菁良，GW-OPSM001）按比例稀释进入 K562 细胞系 RNA，将横跨融合基因断点位置的 Spanning Reads 进行数据量均一化后的结果作图，1 Gb 测序数据量。
在另一对比实验中， NanOnco Plus Panel v2.0 对同一样本（EML4-ALK阳性）进行 DNACap 和 RNACap，在相同样本量、相同测序量下，RNACap富集到超过20条融合reads，而DNACap没有获得相应的基因组水平融合序列（图2）。由此可见 RNACap 相对 DNACap 在融合基因分析上可以达到更高的灵敏度。
▶ 图 2 | 同一样本 DNACap 和 RNACap 测序 reads 在基因组上 EML4-ALK 融合区域的比对情况比较。
使用 NanOnco Plus Panel v2.0 进行 DNA、RNA 靶向捕获，1 Gb 测序数据量。
RNACap 的总体灵敏度与捕获基因的表达之和成反比[6]，我们针对实体瘤研究中最为常见或有临床意义的 105 个融合相关基因，基于转录本设计了 OncoFu Elite (for RNA) Panel v1.0（简称为OncoFu E），用于临床常见RNA融合的检测分析。
此 Panel 在肿瘤融合 RNA 参考品（Seraseq FFPE Tumor Fusion RNA Reference Material v4）的 RNACap 数据中，两次重复的中靶率为81%和84%，rRNA 占比均不超过 15%。由图3 可见，参考品中的靶基因 mRNA 被有效富集，平均富集倍数分别达到了 94 和 102 倍，且在基因组内分布相对均匀。
▶ 图 3 | A. OncoFu E 相比 RNA-seq 对靶基因的有效富集；B. 使用 OncoFu E 靶向捕获转录本覆盖度。
此 Panel 在 K562 细胞系的 RNACap 数据中，中靶率 >90%，rRNA 占比均 <7%。相比于 total RNA-seq 和去除 rRNA 的 RNA-seq，对 ABL1-BCR 融合 mRNA（图4）和肿瘤融合 RNA 参考品中已知融合 mRNA（图5）均有显著的富集作用。我们尝试两种方法对肿瘤融合 RNA 参考品进行融合突变检出：1）使用Fusioncatcher calling用来模拟检测未知融合基因；2）统计已知融合参考序列的Spanning Read数量。结果显示，两种分析方法均可稳定、准确识别出肿瘤融合RNA参考品中包含的全部16种融合mRNA（图5）。
▶ 图 4 | RNACap 相比非捕获测序对 K562 细胞系 RNA BCR-ABL1 融合基因的检出。
直接测序 (Total-RNAseq)，去除 rRNA 测序 (RNAseq-rRNAD)、使用 OncoFu E 靶向捕获测序（OncoFu E）。
▶ 图 5 | RNACap 相比非捕获测序对肿瘤融合 RNA 参考品检测能力的提升。
直接测序 (Total-RNAseq)，去除 rRNA 测序 (RNAseq-rRNAD)、使用 OncoFu E 靶向捕获测序（OncoFu E），检测结果为每百万比对 Read 中支持融合的 Spanning Read（FRPMMR）。
纳昂达即将推出OncoFu Elite (for RNA) Panel v1.0，敬请期待在下篇中的更多表现。
参考文献
[1] Gocke CD, Mason J, Brusca L, et al. Risk-based classification of leukemia by cytogenetic and multiplex molecular methods: results from a multicenter validation study. Blood Cancer J 2012; 2(7):e78.
[2] A. Zehir, R. Benayed, R.H. Shah, A. Syed, S. Middha, H.R. Kim, et al. Mutational landscape of metastatic cancer revealed from prospective clinical sequencing of 10,000 patients. Nat Med 2017; pp. 703-713.
[3] K.D. Davies, A.T. Le, J. Sheren, H. Nijmeh, K. Gowan, K.L. Jones, M. Varella-Garcia, D.L. Aisner, R.C. Doebele. Comparison of molecular testing modalities for detection of ROS1 rearrangements in a cohort of positive patient samples. J Thorac Oncol 2018; pp. 1474-1482.
[4] Solomon JP, Benayed R, Hechtman JF, Ladanyi M. Identifying patients with NTRK fusion cancer. Ann Oncol 2019; Nov;30 Suppl 8:viii16-viii22.
[5] Heydt Carina, Wölwer Christina B, Velazquez Camacho Oscar, Wagener-Ryczek Svenja, Pappesch Roberto et al. Detection of gene fusions using targeted next-generation sequencing: a comparative evaluation. BMC 2021; volume 14, Article number: 62.
[6] Heyer EE, Deveson IW, Wooi D, Selinger CI, Lyons RJ, Hayes VM, et al. Diagnosis of fusion genes using targeted RNA sequencing. Nat Commun 2019； 10(1):1388.
[7] Volckmar AL, Leichsenring J, Kirchner M, et al. Combined targeted DNA and RNA sequencing of advanced NSCLC in routine molecular diagnostics: Analysis of the first 3,000 Heidelberg cases. Int J Cancer 2019; Aug 1; 145(3):649-661.
[8] Luthra Rajyalakshmi,Patel Keyur P,Routbort Mark J et al. A Targeted High-Throughput Next-Generation Sequencing Panel for Clinical Screening of Mutations, Gene Amplifications, and Fusions in Solid Tumors. J Mol Diagn 2017； 19; 255-264.
[9] Boyle Theresa A, Mondal Ashis K, Saeed-Vafa Daryoush et al. Guideline-Adherent Clinical Validation of a Comprehensive 170-Gene DNA/RNA Panel for Determination of Small Variants, Copy Number Variations, Splice Variants, and Fusions on a Next-Generation Sequencing Platform in the CLIA Setting. Front Genet 2021; 12: 503830.
