该产品中含有大量的 rRNA ssDNA 封阻试剂，搭配使用 NadPrep® 总 RNA 反转模块得到的双链 DNA 纯化产物中会产生少许 ssDNA 残留。使用核酸荧光定量仪对双链 DNA 进行定量时，残留的 ssDNA 会影响双链 DNA 结果，导致产量偏高，但残留的 rRNA ssDNA 封阻试剂不会影响后续文库构建等分子生物学实验。

均不能。甲基化接头是修饰过的，不能使用普通接头替换；甲基化转化后的文库富含 AT，必须使用甲基化建库试剂盒中适合于扩增 AT-rich 的 2×HiFi-Methyl PCR Master Mix。

人源基因组只有 CpG 中的 C 会发生甲基化修饰，未转化文库的 Human DNA CHG/CHH 指标高。可使用该参数粗略评估转化效率，其准确性与 Lambda DNA CpG Conversion 相比较差。

基因组 DNA 与 Lambda DNA 拷贝数按照 1:10 比例混合，理论上测序深度 1:10。

通过向 gDNA 样本添加 Lambda DNA，然后评估 Lambda DNA CpG 转化率，要求 Lambda DNA 转化效率 >99%。Lambda DNA 添加方式为：1ug gDNA+165pg Lambda DNA，混合均匀后进行 Covaris 打断。

推荐以下操作以提高回收效率：适当增加磁珠与待纯化样本或纯化洗脱液在混匀后的孵育&磁吸时间；适当提高磁珠纯化倍数（如纯化样本步骤，非片筛）；使用新鲜配制的 80% 乙醇；严格控制磁珠晾干的时间，避免过度晾干。

适用于片段化后 DNA 分布范围较宽且期望得到稳定的数据产出的情况。但获得狭窄峰型也会降低文库丰度，故操作少量样本时应注意损耗。双筛分为片段化后双筛、连接后双筛两种。在双筛的过程中短片段损失更多但分布更集中，而长片段与之相反。由于连接后双筛时已引入了接头，因此相对片段化后双筛损失更少，但峰型相对较宽。此时还应注意：
①任意形式的双筛都会带来 DNA 的损耗，因此扩增循环数需要至少增加 1 个循环；
②任意形式的双筛都会带来原始文库丰度的损耗，可能会导致测序数据中的重复率的增加；
③打断片段的平均大小应接近预期片段大小，以减少样本损失。

可能原因为接头未稀释，推荐解决方案：对于低起始量的样本建库，应严格定量并按照说明书推荐进行接头稀释。

可能原因								解决方案
样本严重降解								降解较为严重的样本，如 FFPE C 级样本，同等片段化时间下，DNA 分布可能为 150-200 bp。建议对样本进行分级后按照分级条件设置酶切时间
片段化时间过长								应避免同时手工操作过多样本，操作时间跨度过长会因片段化反应时间被动延长; 反应体系配置尽量低温操作
室温操作时间过长								确保片段化体系各组分在转移至 PCR 仪之前，始终置于冰上； 提前运行 PCR 仪，模块温度稳定后暂停，体系配置完成后立即开始孵育程序

推荐按照如下方式对 FFPE 样本进行分级和实验操作：

分级

分级标准

推荐起始量

酶切时间  (250 bp)

推荐扩增循环数  (250 bp)

FFPE B+

~15 kb  有主带，存在轻微弥散，主带比弥散状带明显

≥  100 ng

与常规  gDNA  一致

与常规  gDNA  一致

FFPE B

~15 kb  有隐约可见主带，同时存在中度弥散

≥  100 ng

比常规  gDNA  缩短约  5 min

比常规  gDNA  多  1-2  个

FFPE C

在  200-2500 bp  之间存在弥散状分布，无清晰主带

≥  100 ng

比常规  gDNA  缩短约  10 min

比常规  gDNA  多  2-3  个

FFPE D

主要分布在  250-1000 bp，呈弥散状

≥  100 ng

比常规  gDNA  缩短约  15 min

比常规  gDNA  多  3-4  个

实验条件：使用 NadPrep® 快速 DNA 酶切文库构建模块 v2 搭配 NadPrep® Universal Stubby Adapter (UDI) Module 对不同分级的 FFPE 样本建库后的文库片段分布如下图所示(Agilent 2100, DNA 1000 Kit)：