| 可能原因 | 解决方案 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DNA 溶液中EDTA 浓度＞1mM | 推荐使用磁珠法或柱式法纯化核酸，并用 Nuclease Free Water 溶解 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DNA 纯度较差 | 样本纯度要求 OD260/ OD280=1.8-2.0; OD260/OD230=2.0-2.5。若样本中存在胍盐及杂蛋白污染时会影响酶切效率，推荐使用磁珠法或柱式法纯化核酸，并用 Nuclease Free Water 溶解 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 反应体系混匀不充分 | 确保片段化 Mix 充分混匀后，再加入样本中，并再次充分混匀后进行反应 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 连接步骤操作不合理导致片段自连 | 严格按照说明书推荐流程操作 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 可能原因 | 解决方案 |
| 起始投入量不准确 | 实际其实投入量偏低，建议使用 Qubit 进行精 确定量 |
| 磁珠纯化过程中丢弃部分磁珠 | 采用涡旋混匀时，确保管盖紧闭，弃上清过程 切勿丢弃磁珠 |
| 可能原因 | 解决方案 |
| 转化后文库被未转化文库污染 | 使用带滤芯 Tips； 转化结束后及时更换新的乳胶手套，更换新的 工作台面以及新的移液器 |
| Bisulfite Reagent 易发生氧化、结晶析出，导 致亚硫酸盐溶液浓度降低，影响转化效率 | 在有效期以内使用 Bisulfite Reagent； 控制 Bisulfite Reagent 暴露在空气中的时 |
试剂盒在没有被紫外灯照射的情况下，在台面室温过夜，可以继续使用。NadPrep® 快速DNA酶切文库构建试剂盒性能稳定，放置在室温下12 h内，建库表现无损。
NadPrep® 快速DNA酶切文库构建试剂盒推荐冻融15次以内。为保证数据质量，建议分装使用，分装前请充分混匀。
为保证数据质量，最好在说明书推荐的范围内建库。如果有特殊的实验需求，也可以适当调整。纳昂达测试的其他input量建库效果如下：
实验条件：Human Genomic DNA Male（Promega，catalog # G1471），分别使用不同的 input 量进行片段化，酶切时间 25 min。搭配 NadPrep® Universal Stubby Adapter (UDI) Module，单筛选建库。文库产出和 size 符合上机需求。
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片段筛选推荐 |
适用情况 |
优点 |
缺点 |
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步骤一 可选步骤： 片段化后双筛 |
DNA样本量丰富； 片段化后片段分布较宽 |
片段更集中，文库连接效率、测序数据均一性较好 |
DNA片段损失量较大 |
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步骤四 可选步骤： 连接后双筛 |
DNA样本量较丰富； 连接后片段分布较宽 |
片段较集中，测序数据均一性较好 |
需要根据样本片段长度严格挑选合适的双筛条件 |
● 片段化后双筛损失量
此步骤筛选可以使片段化样本更加集中，后续接头连接效率高，但是样本损失量比较大（~60-70%），适合样本量丰富的样本建库。建议DNA input量 ≥ 200 ng。
实验条件：Human Genomic DNA Male（Promega，catalog # G1471），500 ng分别使用不同的酶切时间进行片段化，程序：25℃-X min，65℃-30min；片段化程序结束，使用说明书附录二1.1，片段化后双筛条件。筛选完成后使用Nuclease Free water洗脱，进行后续连接接头步骤。
● 连接后双筛损失量
此步骤双筛选相比单筛选文库损失15-25%，使文库峰形更加集中的同时相比片段化后双筛选减少了文库损失，但低质量DNA样本或Input DNA ≤ 50 ng时不建议使用。
实验条件：Human Genomic DNA Male（Promega，catalog # G1471），100 ng分别使用不同的酶切时间进行片段化，在完成接头连接后分别使用单筛选和双筛选模式（详见说明书附录二1.2）。
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品牌 |
试剂盒名称 |
货号 |
洗脱溶剂名称 |
洗脱溶剂组成 |
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Promega |
MagneSil Blood Genomic, Max Yield System |
MD1360 |
Elution Buffer |
(10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 8.0) |
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QIAGEN |
QIAamp DNA FFPE |
56404 |
Buffer ATE |
(10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 8.0) |
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GeneRead DNA FFPE Kit |
180134 |
Buffer ATE |
(10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 8.0) |
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DNeasy Blood & Tissue Kit |
69506 |
Buffer EB |
10 mM Tris-Cl, pH 8.5 |
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Thermo Fisher Scientific |
PureLink Genomic DNA Mini Kit |
K182001 |
Elution Buffer |
10 mM Tris-HCl, pH 9.0, 0.1 mM EDTA |
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天根生化科技 |
磁珠法通用型基因组DNA提取试剂盒 |
DP705 |
Buffer TB |
10 mM Tris-Cl, pH 8.0 |
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血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒 |
DP304 |
Buffer TE |
(10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 8.0) |
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石蜡包埋组织DNA提取试剂盒 （离心柱型） |
DP331 |
Buffer TE |
(10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 8.0) |
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康为世纪 |
Blood Genomic DNA Midi Kit (1-5ml) |
CW0541 |
Buffer GE |
10 mM Tris，0.1 mM EDTA（pH 8.5） |
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FlexGen Blood DNA Kit (0.1-20ml) |
CW0544 |
Buffer GE |
10 mM Tris，0.1 mM EDTA（pH 8.5） |
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FFPE DNA Kit |
CW0547 |
Buffer GE |
10 mM Tris，0.1 mM EDTA（pH 8.5） |
主要因素①样本质量差异：样本是否降解。降解的样本可根据说明书参考时间，以 3-5 min 梯度缩短酶切时间。
②样本溶剂：含有 EDTA 或过高 pH（pH大于8.0，如 pH 8.5）的溶剂。样本中有 EDTA 存在时，如未纯化，也未加入 Enhancer Buffer，或者溶剂 pH 过高会造成片段化不足，文库 size 过大不符合上机需求。
如下图：
血液 gDNA 样本含不同量的 EDTA 终浓度建库，input 50 ng，酶切时间 25 min，扩增 6 个循环。使用 Qsep 100进行片段质检：EDTA 浓度越高，酶切片段越大。
NadPrep® 快速DNA酶切文库构建试剂盒v2 兼容多种类型样本的文库构建，包括全血 gDNA、FFPE 等。对于复杂样本的处理（如 FFPE 样本），推荐从源质控，DNA 样本中若有蛋白质、酚类等杂质残留，可能会影响酶切打断效果。另酶切片段化试剂多对 EDTA 浓度敏感，应避免使用含 EDTA 的溶剂溶解，如有必要可进行 1.8-2.0× 磁珠纯化去除。
● 样本溶剂：推荐使用无核酸酶水或 10 mM Tris-HCl (pH 7.5-8.0) 溶解 DNA 样品（酶切片段化试剂对 EDTA 浓度敏感，此步骤需确认溶剂中 EDTA 的浓度。过高的溶剂 pH 可能会影响酶活，造成片段化程度不足，如有必要可进行 1.8X 磁珠纯化）。
● 样本定量：常规 gDNA 样本推荐使用基于分光光度计原理的 NanoDrop 和基于双链 DNA 荧光染料的 Qubit®、PicoGreen® 进行定量。
● 样本纯度：OD260/OD280=1.8-2.0；OD260/OD230=2.0-2.5。
● 样本片段分布：可推荐使用 1% 的琼脂糖凝胶电泳进行样本 size 检测或生物分析仪（如Agilent 2100）DIN 值进行样本完整性评估。样本的分级可参照下图简单分为四级（此为基础的四级分类法，也可根据实际情况进行更为细致的划分）。不同等级的 FFPE 样本酶切时间可参考说明书上下调整时间。
