- 若共建库样本为共提取 total 核酸样本，需同时对样本中的 RNA 和 DNA 进行 Qubit 定量，并按说明书推荐扩增循环进行文库扩增。
- 实验过程中须使用 RNase-free 耗材，操作环境确保无 RNase 污染，否则会影响 RNA 样本的反转效率。
- 共建库核酸样本中若含有过多的螯合剂、胍盐、苯酚、蛋白质、乙醇等杂质，会影响 RNA 反转录酶活性以及 DNA 酶切效率，建议使用 2X NadPrep® SP Beads 纯化核酸样本，替换洗脱试剂为 Nuclease Free Water 后再进行文库构建。
- 质量较差的样本可以适当提高 PCR 扩增循环数。
共建库核酸样本中若含有较高浓度的 EDTA 或过高 pH 会影响 DNA 的酶切效率，建议使用 2X NadPrep® SP Beads 纯化核酸样本，替换洗脱试剂为 Nuclease Free Water 后再进行文库构建。
本试剂盒可以耐受含 EDTA（1 mM）的核酸样本 6 µL，即 cDNA 一链合成体系 EDTA 终浓度为 0.3 mM，此时 RNA 反转录抑制较少，且该浓度下共建库酶切效果无影响。建库前先确认样本溶剂，若超过推荐 EDTA 临界值则需要使用 2X NadPrep® SP Beads 纯化核酸样本，替换洗脱试剂为 Nuclease Free Water 后再进行文库构建。
混合核酸样本进行 RNA & DNA 共建库时，DNA 样本占比越多，酶切片段越大。可以参考说明书中预期插入片段长度和推荐酶切时间进行适当调整。
本试剂盒构建的文库可搭配 NEX-t Panel v1.0 和 NadPrep®️ ES Hybrid Capture Reagents 使用，可显著缩短病原靶向测序耗时，同时简化实验步骤。
图 1. DNA 样本经不同建库方案的文库产出和捕获表现。A. 文库产出；B. 捕获数据的比对率。
注：样本来源为 50 ng 人类基因组 DNA 标准品 (Promega, G1521)。测序模式为 Illumina Novaseq 6000, PE150。
图 2 . RNA 样本经不同建库方案的捕获文库的 ERCC 表达谱相关性。A. NadPrep® RNA & DNA Library Co-Preparation Module ；B. NadPrep® Total RNA-To-DNA Module 衔接 NadPrep® DNA Library Preparation Module 。
注：样本来源为 K562 细胞系 RNA，起始投入量为 50 ng；预文库投入量 200 ng。
建议严格按照使用说明中要求进行使用和保存。内部测试 Bisulfite Reagent 在开盖超过 3 次后，文库产出略微降低， Lambda DNA 转化率无明显影响；为了达到产品最佳性能，建议开盖不超过 3 次。