临床标本的质量直接影响检测结果。不同标本类型受定植菌影响的程度不同，由此导致 tNGS 检测结果的可信度存在差异。

不同类型的临床标本采集要求

样本类型	样本量	DNA 样本要求			RNA 样本要求
		采集容器	储存条件	运输条件	采集容器	储存条件	运输条件
血液	≥ 10 mL	保存液采血管	4℃ 保存一周	冰袋低温运输	保存液采血管	4℃ 保存一周	冰袋低温运输
肺泡灌洗液	≥ 10 mL	无菌螺旋管	-80℃ 长期保存	干冰运输	无菌螺旋管	-80℃ 长期保存	干冰运输
痰液	≥ 3 mL	无菌螺旋管	-80℃ 长期保存	干冰运输	无菌螺旋管	-80℃ 长期保存	干冰运输
脑脊液	≥ 2 mL	无菌螺旋管	-80℃ 长期保存	干冰运输	无菌螺旋管	-80℃ 长期保存	干冰运输
胸水	≥ 25mL	无菌螺旋管	-80℃ 长期保存	干冰运输	无菌螺旋管	-80℃ 长期保存	干冰运输
腹水	≥ 25 mL	无菌螺旋管	-80℃ 长期保存	干冰运输	无菌螺旋管	-80℃ 长期保存	干冰运输
骨髓	≥ 0.5 mL	无菌螺旋管	-80℃ 长期保存	干冰运输	无菌螺旋管	-80℃ 长期保存	干冰运输
其他体液	≥ 10 mL	无菌螺旋管	-80℃ 长期保存	干冰运输	无菌螺旋管	-80℃ 长期保存	干冰运输
粪便	黄豆粒大小	无菌螺旋管	-80℃ 长期保存	干冰运输	无菌螺旋管	-80℃ 长期保存	干冰运输
拭子	≥ 3支	保存液采样管	-80℃ 长期保存	干冰运输	保存液采样管	-80℃ 长期保存	干冰运输
新鲜组织	米粒大小	组织采样管	-80℃ 长期保存	干冰运输	组织采样管	-80℃ 长期保存	干冰运输

主要信息来源于《高通量测序技术在分枝杆菌病诊断中的应用专家共识》。

核酸提取的质量是决定高通量测序检测成功的关键，不同的操作实验室都应建立完整的核酸提取流程。首先要对选取的核酸提取试剂盒进行验证，以确保核酸提取的效率及完整性，并对每次提取的核酸样本进行定量检测，以确保核酸满足后续实验要求，同时建立合格核酸样本的标准。

核酸质量验证：

(1) 高质量的 DNA A₂₆₀/A₂₈₀ 应在 1.7~1.9，A₂₆₀/A₂₃₀ 应 > 2，可用 1% 琼脂糖凝胶电泳验证 DNA 的质量 (无杂带、无拖尾、背景无蛋白污染)。

(2) DNA 完整性 (如 Agilent 2100 Bioanalyzer) 检测，如果大部分片段在 200 nt (血浆游离 DNA 除外，140 nt) 以下说明 DNA 降解严重，需重提。

(3) 高质量的 RNA A₂₆₀/A₂₈₀ 应在 1.8~2.0，A₂₆₀/A₂₃₀ 应 > 2。

(4) 微量的核酸采用 Qubit 荧光染料法进行定量测定。

综上，在临床样本采集时确保足量的的样本进行核酸提取，以获得更高丰度的核酸样本；tNGS 构建的文库中含有的病原微生物的丰度越高，则 tNGS 检测LOD 更低，低载量病原微生物也能够高效检出。

主要信息来源于《高通量测序技术在分枝杆菌病诊断中的应用专家共识》和《高通量宏基因组测序技术检测病原微生物的临床应用规范化专家共识》。

NEX-t Panel v1.0 靶向从数百种病原 (病毒、细菌、真菌、寄生虫) 基因组中挑选的一系列特征序列，涵盖了 16S/ITS、看家基因、耐药相关基因等丰富内容。一次检测涵盖 450+ 属，全面覆盖 7000+ 种病原微生物，满足临床 99% 以上病原检测需求。

tNGS 病原微生物检测全流程包括：核酸提取 (1.5 hr)、RNA/DNA 文库构建 (~5.5/2.5 hr)，杂交捕获 (~4 hr)、NGS 测序 (~5 hr)、生信分析及自动化解读报告 (~0.5 hr)，总耗时共计约 13.5~16.5 hr。

为了更快速地获取临床标本中病原微生物的鉴定结果，推荐使用华大智造 DNBSEQ-G99 (SE100) /DNBSEQ-E25 (SE100)，允许最短运行时间 5 hr；或 Illumina MiniSeq/MiSeq (SE100)，允许最短运行时间 5 hr。

实际测序获得的数据量跟临床标本中病原微生物的含量有关；是否出报告具体是根据检测到的病原的支持 reads 数，与测序获得的总数据量无关。若预测可信的病原微生物在报告中显示未检出，即使在数据量足够的情况下，也可建议增加数据量再进行生信分析或采取 PCR 进行验证；相反，若测序获得的数据量极低，但是检测到了足够数据量支持的病原微生物，也同样会出报告。

在病原检测过程中，SE 模式更节省时间，因此比 PE 模式更常用。不管选用何种测序模式，只要检测到足量的 reads，均可用于病原分析，不太会影响最终的结果判定。若选用 SE50/75 测序模式，不需要增加测序数据量。目前的 Demo 数据中实际测序模式为 PE150，可模拟为 SE50 或 SE100 的数据进行分析，对最终的结果判定影响不会太大。

• 一般来说，对病原微生物基因组进行完整的探针覆盖是无法实现的。一方面是由于在考虑参考基因组以外的序列多态性时，一种细菌所需的探针即可达数十万条；另一方面是由于当病原序列与宿主序列存在一定相似性时，为防止脱靶，需要舍弃这些区域。因此，NEX-t Panel v1.0 在探针设计时侧重于以最少的探针实现最多的病原分析功能，panel 规模相比于常见的杂交捕获 tNGS 方案大为精简。
• 探针条数可近似等效于多重扩增子的扩增子个数，但由于探针具有更高的容错性，同时还能捕获到探针侧翼的序列；因此，一定数量的探针可获得比相似扩增子个数的多重扩增更丰富的信息。
• 与多重扩增子相比，杂交捕获 Panel 的扩展更为简单，只需增加探针。因此，NEX-t Panel v1.0 可以方便地进行定制和组合升级。

• NEX-t Panel v1.0 推荐与 NadPrep®️ ES Hybrid Capture Reagents 快杂试剂搭配，可有效缩短杂交时间，简化实验步骤；
• 杂交捕获测序比多重扩增子测序更为稳定，失败率更低。

• 病原捕获的中靶率受到病原含量的影响较大。如下图所示，在相同的宿主背景下，随着微生物参考品的梯度稀释，其数据量呈等比例下降的趋势，而中靶率也随之降低。
• 尽管多轮捕获能够显著地提高中靶率，但这种策略同时伴随着信息丢失 (dropout) 的风险。尤其在病原含量较低的情况下，中靶率低，同时也对 dropout 更为敏感。因此，在考虑多轮捕获时需要谨慎权衡利弊。此外，从另一个角度来看，当样本中的病原基因组拷贝数为个位数时，提高中靶率实际上只是将这几个拷贝反复测序，并未产生更多的有用信息。

注：以人类基因组 DNA 标准品 (Promega，G1471) 按照不同比例对 20 菌株交错的混合基因组材料 (ATCC，MSA-1003) 进行稀释以获得 0.001%-1% MSA-1003 的模拟菌群样本。50 ng Input 以 NadPrep® 快速 DNA 酶切文库构建试剂盒 v2 建库，利用 NEX-t Panel v1.0 搭配 NadPrep®️ ES Hybrid Capture Reagents 完成杂交捕获 (杂交 2 h)。测序模式：Novaseq6000， PE150。

测序数据利用 BWA 比对到由 hg19 人类基因组和 20 种微生物基因组参考序列组成的参考基因组，统计 reads 分布。