|
可能原因 |
解决方案 |
|
DNA 溶液中 EDTA 浓度 > 1 mM |
推荐使用磁珠法或柱式法纯化核酸，并用试剂盒提供的 TE Solution 溶解。 |
|
DNA 纯度较差 |
样本纯度要求 OD260 / OD280 =1.8-2.0；OD260 / OD230 =2.0-2.5。 若样本中存在胍盐及杂蛋白污染时会影响酶切效率，推荐使用磁珠法或柱式法纯化核酸，并用试剂盒提供的 TE Solution 溶解。 |
|
反应体系混匀不充分 |
确保片段化 Master Mix 充分混匀后，再加入样品中，并再次充分混匀后进行反应。 |
|
可能原因 |
解决方案 |
|
样本严重降解 |
降解较为严重的样本，如 FFPE C 级样本，同等片段化时间下，DNA 分布可能为 150-200 bp。 |
|
片段化时间过长 |
应避免同时手动操作过多样本，可能因操作时间延长而导致片段化反应时间被动延长。 |
|
室温操作时间较长 |
确保片段化体系各组分在转移至 PCR 仪之前，始终置于冰上。 |
可能原因为接头未稀释，推荐解决方案：
对于低起始量的样本建库，应严格定量并按照说明书推荐进行接头稀释。
总 RNA 逆转录模块兼容多种类型样本，包括细胞、组织、FFPE 样本等。对于复杂样本的处理（如 FFPE 组织样本），推荐从源质控。样本应选取合适的提取试剂盒，并进行相应的定量及片段质检，建议如下：
|
类别 |
要求 |
|
|---|---|---|
|
提取试剂盒推荐 |
细胞系 RNA |
AllPrep DNA/RNA Mini Kit（Qiagen；货号，80204） |
|
FFPE RNA |
AllPrep DNA/RNA FFPE Kit（Qiagen；货号，80234） |
|
|
定量 |
基于分光光度计原理的 NanoDrop 和基于荧光染料的 Qubit®RNA HS Assay定量 |
|
|
纯度 |
OD260/OD280=1.7~2.0。OD260/OD280 > 2.0 表明有异硫氰酸污染，< 1.7 表明有蛋白质等污染 |
|
|
完整性 |
定量法 |
RNA IQ（By Qubit™ RNA IQ Assay Kit）＞4 RIN（ByAgilent 2100）＞3 DV200（By Agilent 2100；＞200 nt RNA所占比例）＞50 % |
|
条带检测法 |
2% 的琼脂糖凝胶电泳或生物分析仪，如 Agilent 2100、Bioptic（Qsep）进行样本完整性评估。 |
|
纳昂达内部测试了直接测序（Total
RNA-seq）、去除rRNA后测序（rRNA-depleted
RNA-seq）和捕获后测序（RNAcap）。结果显示，Total
RNA-seq 与 rRNA-depleted RNA-seq 的基因表达基本一致，且无明显富集，RNAcap 则可明显富集靶区域。
图 1. Total RNA-seq、rRNA-depleted RNA -seq 和 RNAcap 的结果分析。
纳昂达推荐提取后的总 RNA 使用总 RNA 逆转录模块搭配 DNA 通用建库模块及靶向捕获模块，进行 RNAcap 的靶向捕获，可获得更高的测序量及目的靶区域信息。
NadPrep® 血浆游离 DNA 双端分子标签文库构建试剂盒对 cfDNA 样本的定量及片段质检，建议如下：
|
类别 |
要求 |
||
|---|---|---|---|
|
提取试剂盒推荐 |
cfDNA |
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit（Qiagen；货号：55114） |
|
|
溶剂 |
推荐使用无核酸酶水、0.1 × TE（low TE）、10 mM Tris-HCl（pH 8.0~8.5）或提取试剂盒配备的Buffer溶解DNA样品。酶切片段化试剂多对EDTA浓度敏感，应避免使用含EDTA的溶剂溶解。如有必要可进行1.8-2.0 ×磁珠纯化去除。 |
||
|
定量 |
基于分光光度计原理的NanoDrop和基于双链DNA荧光染料的Qubit®、PicoGreen®进行定量。 |
||
|
纯度 |
OD260/OD280=1.8-2.0；OD260/OD230=2.0-2.5。OD260/OD280>1.9表明有 RNA 污染，<1.6表明有蛋白质、酚等污染；OD260/OD230<2.0，则表明有碳水化合物、盐类或者有机溶剂污染。 |
||
|
片段分布 |
cfDNA |
Bioanalyzer或Bioptic（Qsep）分析主峰~160 bp，次峰~320 bp。 |
|