NadPrep®DNA 通用型文库构建试剂盒兼容多种类型样本的文库构建，包括全血 gDNA、FFPE、血浆 cfDNA 等。对于复杂样本的处理（如FFPE组织样本），推荐从源质控。样本应选取合适的提取试剂盒，并进行相应的定量及片段质检，建议如下：
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类别 |
要求 |
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提取试剂盒推荐 |
常规gDNA |
血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（天根；货号：DP304） |
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cfDNA |
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit（Qiagen；货号：55114） |
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FFPE组织gDNA |
QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen；货号：56404） |
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溶剂 |
推荐使用无核酸酶水、0.1 × TE（low TE）、10 mM Tris-HCl（pH 8.0~8.5）或提取试剂盒配备的Buffer溶解DNA样品。酶切片段化试剂多对EDTA浓度敏感，应避免使用含EDTA的溶剂溶解。如有必要可进行1.8-2.0 ×磁珠纯化去除。 |
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定量 |
基于分光光度计原理的NanoDrop和基于双链DNA荧光染料的Qubit®、PicoGreen®进行定量。 |
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纯度 |
OD260/OD280=1.8-2.0；OD260/OD230=2.0-2.5。OD260/OD280>1.9表明有RNA污染，<1.6表明有蛋白质、酚等污染；OD260/OD230<2.0，则表明有碳水化合物、盐类或者有机溶剂污染。 |
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片段分布 |
常规gDNA |
1%的琼脂糖凝胶电泳时，>15 kb的清晰主带。 |
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cfDNA |
Bioanalyzer或Bioptic（Qsep）分析主峰~160 bp，次峰~320 bp。 |
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FFPE组织gDNA |
1%的琼脂糖凝胶电泳或生物分析仪，如Agilent 2100进行样本完整性评估。 |
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接头比例过高会导致接头或接头二聚体残留；接头比例若不足则会影响连接效率进而降低文库产量。接头使用还应注意保存方式、稀释方法和稀释浓度：
• 保存：避免反复冻融，如欲多次使用，应提前分装；
• 稀释液：推荐使用试剂盒内TE Solution进行接头的稀释，但稀释液不建议长期保存；
• 稀释用量：根据样本起始投入量、片段大小，计算合适的接头与DNA片段摩尔比，可达最佳产量。
• 实验操作：保持连接反应在冰上进行，接头与连接体系分别加入，避免提前自连。
• 不同的接头类型应用推荐如下表：
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应用 |
推荐NadPrep接头 |
可选NadPrep接头 |
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全基因组、宏基因组、液相杂交靶向捕获测序 |
Universal Adapter (SI/DI) Module |
BMI Adapter (SI/DI) Module |
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RNA测序 |
BMI Adapter (SI/DI) Module |
Universal Adapter (SI/DI) Module |
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低频突变检测（~1%或以下突变频率） |
BMI Adapter (SI/DI) Module |
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适用于片段化后DNA分布范围较宽且期望得到稳定的数据产出的情况。但获得狭窄峰型也会降低文库丰度，故操作少量样本时应注意损耗。双筛分为片段化后双筛、连接后双筛两种。在双筛的过程中短片段损失更多但分布更集中，而长片段与之相反。由于连接后双筛时已引入了接头，因此相对片段化后双筛损失更少，但峰型相对较宽。此时还应注意：
• 任意形式的双筛都会带来 DNA 的损耗，因此扩增循环数需要至少增加 1 个循环；
• 任意形式的双筛都会带来原始文库丰度的损耗，可能会导致测序数据中的重复率的增加；
• 打断片段的平均大小应接近预期片段大小，以减少样本损失。
推荐以下操作以提高回收效率：适当增加孵育时间；适当提高磁珠纯化倍数（如纯化样本步骤，非片筛）；使用新鲜配制的 80% 乙醇。
针对不同建库方式及后续应用，推荐的定量方法如下:
• 常规文库：使用 Qubit 进行定量；
• 应用于多样本混杂的靶向捕获测序文库：为提高数据均一性，可使用qPCR绝对定量的方法进行浓度测定，如：VAHTSTM Library Quantification Kit for MGI，Vazyme，货号：NQM101-NQ106。
文库长度分布可通过凝胶电泳、Bioanalyzer或者 Bioptic（Qsep）等生物分析系统进行检测，但应注意不同分析仪器的文库片段读数可能会存在一定的偏差。常见的异常文库片段分布原因如下：
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异常峰型 |
产生原因 |
解决办法 |
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有短片段（~100 bp）小峰 |
接头冗余 |
合适的Input DNA量和接头使用量；注意加样及连接条件 |
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有双峰（额外单个短片段峰） |
过度扩增 |
降低Input DNA量，降低扩增循环数 |
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额外有长片段峰 |
磁珠残留 |
纯化步骤时小心操作，以去除全部磁珠 |
除适配纳昂达科技自有靶向捕获体系外，文库也适配市面上多种靶向捕获体系，如 Twsit（Twist Custom Panel）、IDT（IDT xGen™ Lockdown™ Probes）、Agilent （Agilent SureSelect）、Roche（ Roche® NimbleGen™ SeqCap™ EZ）、艾吉泰康（TargetSeq®液相探针捕获技术）等。